Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.
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Artigo de método
Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Organoides renais gerados a partir de hPSCs forneceram uma fonte ilimitada de tecido renal. Os organoides renais humanos são uma ferramenta inestimável para estudar doenças e lesões renais, desenvolver terapias baseadas em células e testar novas terapêuticas. Para tais aplicações, um grande número de organoides uniformes e ensaios altamente reprodutíveis são necessários. Nós construímos nosso protocolo organoide renal publicado anteriormente para melhorar a saúde geral dos organoides. Este protocolo 3D simples e robusto envolve a formação de corpos embrióides uniformes em meio de componente mínimo contendo lipídios, suplemento de insulina-transferrina-selênio-etanolamina e álcool polivinyl com inibidor GSK3 (CHIR99021) por 3 dias, seguido pela cultura em meio contendo soro de reposição de soro de knock-out (KOSR). Além disso, ensaios agitados permitem a redução da aglomeração dos corpos embrionários e a manutenção de um tamanho uniforme, importante para reduzir a variabilidade entre organoides. No geral, o protocolo fornece um método rápido, eficiente e econômico para gerar grandes quantidades de organoides renais.
Introdução
Nos últimos anos, uma série de protocolos para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em organoides renais foram desenvolvidos 1,2,3,4,5. Os organoides renais forneceram uma importante ferramenta para auxiliar a pesquisa em novas abordagens de medicina regenerativa, doenças relacionadas ao rim, realizar estudos de toxicidade e desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. Apesar de sua ampla aplicabilidade, os organoides renais têm limitações como falta de maturação, capacidade de cultura limitad....
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Protocolo
Todos os experimentos utilizando hPSCs foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, e foram realizados em uma capa de biossegurança classe II com equipamentos de proteção individual adequados. Todos os reagentes são de grau de cultura celular, a menos que seja dito o contrário. Todas as culturas são incubadas a 37 °C, 5% de atmosfera de ar CO2 . Em todas as etapas do ensaio, corpos embrionários ou organoides renais podem ser coletados e fixados ou preparados para análise. As linhas hPSC utilizadas para gerar esses dados foram totalmente caracterizadas e publicadas18.
1. Preparando placa....
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Resultados
Nesta versão mais recente do nosso protocolo, a diferenciação organoide renal é iniciada em um meio de proteína definido e baixo. Os ensaios são realizados inteiramente em suspensão e contam com a capacidade inata de diferenciação e organização dos HPSCs para o início da tubulogênese. Um único ensaio originário de uma placa de cultura hPSC de 100 mm ~60% confluente produz rotineiramente 500-1.000 organoides renais, como mostrado em nossa publicação anterior5. Devido a um número tão alto de organoi.......
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Discussão
Estudos anteriores mostraram que as etapas iniciais do protocolo são fundamentais para a diferenciação intermediária do mesoderm 5,19,20 e, portanto, é essencial implementar uma rigorosa composição média nesta fase. Remover componentes indefinidos como soro, albumina, híbridomoico livre de proteínas II do primeiro estágio do protocolo pode ajudar a melhorar a eficiência de diferenciação consistente entre os ensaios
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelos Institutos Nacionais de Saúde R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e asan Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Solução de enxágue anti-aderência | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | Estoque de 10 mM em DMSO |
| Corning frascos giratórios descartáveis | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment placas de 6 poços | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Agitadores de baixa velocidade Corning | Fisher Scientific | 11-495-03 | Agitador magnético multiplaca para cultura de frasco giratório |
| Exibir | STEMCELL Technologies | 7923 | Alíquota e congelar |
| DMEM, baixo teor de glicose, piruvato, sem glutamina, sem vermelho de fenol | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, sem cálcio, sem magnésio | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Barras de Agitação para Ovos / Oval | 2mag | PI20106 | |
| Excelta Pinças de Uso Geral | Fisher Scientific | 17-456-103 | Mantenha estéril no exaustor de cultura de células |
| Frasco de Mídia de Uso Único EZBio, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Usado para fazer PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Plates (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Pipeta de Aspiração Estéril 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Marca Fisher Rotadores 3D Multifuncionais | Fisher Scientific | 88-861-047 | Agitador Orbital |
| Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Matriz de Membrana Basal | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Alíquota no gelo e congelar. Outra alternativa de matriz adequada é Matrigel ou Cultrex. |
| Reagente de Dissociação Celular Suave | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Suplemento | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamina. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulina-Transferrina-Selênio-Etanolamina | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Reposição de Soro - Multi-Espécies | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Mistura de lipídios de alíquota e congelamento |
| 1, Quimicamente Definida | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sistema de Filtração a Vácuo Estéril 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Sistema de Filtração a Vácuo Estéril Stericup Quick Release-GP 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Solução de Limpeza | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Detergente adequado para cultura de tecidos. Faça uma solução a 5% em água |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF e mTeSR Plus medium também foram testados e são alternativas adequadas. |
| Nunc 50 mL Cônico, Tubos de Centrífuga Estéreis | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéreis | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher | 15-140-122 | Alíquota e congelamento |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Alíquota e congelar |
| filtro® 200 µ m | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µ m | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poli(álcool vinílico) 87-90% hidrolisado (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% em DPBS mexendo a 98 graus C até dissolver, faça em 138-3211-FLS |
| Inibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | Estoque de 10 mM em DPBS |
| Pipetas Sorológicas Descartáveis Estéreis - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Pipeta sorológica descartável estéril - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Sem soro, meio de base de baixa proteína para E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distribuidor | 2mag | VMF 90512 | Se você usar mais de um MIXdrive |
Referências
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney ....
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Reimpressões e permissões
