此协议为使用同一组大鼠重复的对象定位任务提供了详细的步骤。弱而强的编码可以产生短期和长期的记忆。重复协议的灵活性可以通过节省时间和劳动力来促进涉及手术的研究。
物体位置识别是研究啮齿动物空间记忆的一种突出方法。此对象放置识别内存是对象位置任务的基础。本文提供了一个广泛的协议,以指导建立一个对象定位任务,选择使用同一组老鼠最多四次重复。弱编码协议和强编码协议可用于研究强度不同的短期和长期空间记忆,并能够实施相关的内存抑制或增强操作。此外,重复此处介绍的反平衡测试允许将两个或多个测试的结果组合起来进行主题内比较,以减少大鼠之间的变异性。这种方法有助于提高统计能力,并强烈推荐,尤其是当运行实验,产生高变化的个人行为。这直接通过增加从每种动物获得的数据和减少所需的动物总数来完善研究。最后,通过节省时间和劳动力,实施重复的对象定位任务,提高了涉及外科手术的研究效率。
自发识别任务(如物体识别、对象位置识别)在啮齿动物记忆的调查中得到了很大程度的利用。这些测试不同于用于评估基于恐惧调理或奖励动机的记忆的各种测试,因为自发识别任务仅基于针对新刺激的自发探索行为。这种行为,被称为”新偏好“1,是内在的啮齿动物,以及其他哺乳动物物种和一些非哺乳动物,如鸟类和鱼类2。对象位置识别,这取决于空间内存,可以使用对象位置任务(也称为空间对象识别任务)3来观察。病变研究表明,物体位置识别需要一个完整的海马体4,5。由于相对简单的培训协议和没有任何增援,这项任务在许多研究中是可取的。缺乏正增援和负强化将可能驱动行为的其他参数和大脑区域最小化。因此,这里的行为是中立的,基于好奇心和空间记忆,允许调查参与空间记忆编码、整合和检索的机制。
对象定位任务的规程通常包括习惯会话,然后是单个编码和测试试验会话,除以延迟期,延迟期从几分钟到数小时不等。强烈建议事先处理老鼠,以尽量减少动物的压力水平,因此,行为可能会影响识别记忆,如厌恶新奇。同样,精心设计的习惯协议在防止压力方面起着至关重要的作用,这种压力可能会阻碍大鼠在任务期间的自然行为。然而,处理和习惯的程度因实验室和实验者而异,这可能导致6、7、8的可复制性低。在编码试验中,大鼠有时间探索一个竞技场,两个相同的物体位于两个指定的角落。在测试试验中,大鼠被给予了时间用同一对物体探索竞技场,但这次其中一个被移到了一个新的位置。大鼠表现出的自发偏好以及由此导致在新位置探索物体所花费时间的增加,都表明空间识别和物体位置的记忆3。编码试用的修改(持续时间和重复次数)会影响记忆的强度。
根据研究目的,编码和测试试验之间的延迟长度可以修改为模拟蛋白质合成独立的短期记忆或蛋白质合成依赖的长期记忆。因此,对象定位任务可用于各种研究,根据需要调整协议。此外,在这些试验之间也有可能实施实验性操作,如药理学和光遗传学干预,就像在活体成像中一样。有几项研究9,10报告在同一大鼠群中的物体位置任务的重复迭代。这与传统用途形成鲜明对比,即一种动物有一个会话,没有重复。然而,这些范式的有效性尚未得到彻底调查,也没有描述这些范式的任何方法性文件。据我们所知,这是第一次报告的对协议的描述,该协议详细描述了使用同一鼠群重复最多四次的对象定位任务,其中还系统地比较了每次重复的结果。重复可用于平衡实验条件,以便在主体内与测试之间的变异性降低进行比较。任务的可靠重复允许数据进行汇集,这意味着使用相对较少的鼠标可以生成足够多的数据。最后,重复使用同一只大鼠可以有利于在涉及手术和植入的实验中降低所需的大鼠数量,从而节省时间和人工成本。
这项研究提出了一个广泛的协议,详细说明了如何使用强弱编码试验在成年大鼠中执行对象定位任务,然后以1小时和24小时延迟进行试验。强编码协议在测试1小时和24小时延迟时产生具有统计学意义的识别记忆,因此可用于研究实施操作时的短期和长期记忆,以抑制这些记忆11。相比之下,弱编码协议仅在 1 小时延迟测试时产生显著的短期内存。缺乏长期记忆可用于研究增强记忆保留的操作。此协议还包括详细的处理和习惯会话,旨在提高对象定位任务的可复制性。本文还演示了使用弱编码协议的同一组大鼠在四个不同的上下文中重复任务,该协议被确认每次都能产生可复制和一致的结果。
对象定位任务可用于各种研究,以调查前面描述的空间记忆。设置的灵活性使不同优势的短期和长期记忆建模,并且可以轻松地以低成本实现。但是,由于协议中有许多参数可以影响结果,并且这些参数6中不同的研究略有不同,因此首次成功执行任务可能会遇到困难。上述协议旨在引导读者顺利地完成此过程。下文将讨论在成功执行具有高度可复制性的任务方面可能具有重大意义的进一步关键步骤。
虽然编码/测试会话往往是运行对象位置实验时的焦点,处理和习惯协议对这类行为测试的结果有深远的影响,其结果取决于不受干扰的自然大鼠行为14,15。因此,编码/测试会话前的步骤应谨慎设计,因为它们会影响鼠的行为和记忆,从而影响最终结果。良好的处理和习惯水平,使大鼠熟悉实验者,任务将尽量减少压力因素的影响,同时增加表现出自然行为的可能性8。如协议中所述,如果在家庭设施中保持鼠株,处理可以尽早开始断奶幼崽。根据以前的经验(数据没有显示)和从以前的几个研究16,17,这种早期处理导致低焦虑和增强的好奇心,在随后的几个月。
由于物体定位任务完全取决于大鼠的内在探索驱动,如果大鼠不急于探索或不愿接近新奇事物,预期行为很容易受到阻碍,即所谓的”新恐惧行为”因此,强烈建议根据研究的具体需要,包括一个彻底的处理和习惯协议。此协议可用作最低要求指南,并可以实施进一步步骤(例如,如果研究要在稍后阶段包括注射,则需要习惯注射程序和特定持有位置)。实验鼠的应变和年龄是另外两个影响因素,在计划实验之前应考虑避免结果不理想。不同的大鼠菌株可能有不同的行为和基线焦虑水平18,19,20,因此,根据使用的菌株,可能需要对协议进行具体调整。
该协议被证实与Th-Cre转基因大鼠配合良好,长埃文斯菌株与李斯特胡德菌株和野生型李斯特胡德大鼠背对四次。在行为实验中,大鼠在逻辑上理想的起始年龄在12周20左右,但应考虑应考虑间应变异性和任务的具体要求。如果对研究感兴趣,也可以使用发育中的大鼠,尽管可能需要对协议进行调整,但此处未涵盖。然而,重要的是要考虑在给定年龄的老鼠是否已经发展了成功执行这项任务所需的认知功能。一项21日 对此进行的调查报告说,只有产后第38天而不是之前的青春期大鼠,显示出同心空间记忆反映在偏爱物体的新地点,如成年大鼠所观察到的。这里提出的协议是成功的使用鼠是15-16周大,在第一次编码/测试会议开始。以前,同样的强编码协议在使用23周大的老鼠时,由于在足够小的时候缺乏处理和习惯,没有达到最佳的适应水平,结果会低于最佳到负。这些大鼠要么没有表现与偶然水平不同,要么事实上表现出对新奇事物的厌恶,如对稳定物体的偏好,而不是对被移位物体的偏好(未显示数据)。这些结果提供了证据,证明处理习惯的年龄和时间可能对习惯的有效性产生影响,因此有助于在测试中观察焦虑和新恐惧行为。
在此,概述了两个不同的协议,确保对象位置任务中的强或弱编码。在这些协议的建立过程中,人们观察到,在单次长时间试验(例如20分钟编码)中,对这些物体的兴趣在5-10分钟的探索后下降, 大鼠最终停止了探索。这会导致对象位置的内存变弱。一种编码协议,将编码试验与短的休息时间(例如,3 x 5 分钟的编码)交织在一起,克服了这一点,并导致在整个试验过程中进行高度探索。因此,这两个编码协议的主动探索时间和不同的布局会影响内存的强度,在 3 x 5 分钟编码后,内存的强度比 20 分钟编码协议后更强。类似的结果也可以使用略有不同的持续时间与单一试验与交错试验协议,并可以作出调整,以适应研究的需要和大鼠应变。
与使用仅带有外部提示的纯白色开放字段的协议相反,此处介绍的协议使用具有不同上下文和迷宫内提示的竞技场,可能需要更多时间来学习。因此,建议在编码试用之前在协议中添加上下文习惯步骤。这将允许大鼠在习惯期间形成每个上下文的空间地图,并缩短以下编码试验的持续时间,因为大鼠只需对与此地图相关的对象位置进行编码。此外,上下文习惯将允许大鼠在每个上下文中习惯任何可能的注意力干扰器,如 3D 空间提示,以尽量减少编码/测试会话中对象探索以外的行为。随着一个彻底的平衡方法的实施,包括几个级别(即 广泛的对象位置组合(计数器)和对象位移的方向),由于光强度和竞技场角落的墙壁颜色/图案的变化,可能会上升的不需要的偏好被最小化。
重复任务时应考虑几个因素,以增加编码/测试会话之间的可重复性,并最大限度地减少重复的影响。首先,需要设计不同的上下文(编码/测试会话的重复次数)以避免使用相同上下文执行重复会话可能造成的空间内存积累。为此,使用了不同颜色和图案的可更换墙壁的装置(图1B,C)。墙上悬挂的不同墙壁和 3D 物体(如玩具或不同颜色和形状的小日常物品、参见协议和图 1C)是老鼠可能用来了解与其上下文相关的对象位置的空间线索和地标。如果测试未能产生对移动对象的偏好,则可以考虑更改上下文的这些参数(墙面设计和空间提示)。或者,矩形或圆形竞技场可用于对象定位任务,而不是此协议中那样的方形竞技场。据报道,圆形竞技场可以消除在有角落的竞技场中经常观察到的角落偏好22,因此,当处理特别焦虑的老鼠或老鼠菌株时,它可以是有益的。虽然在此协议中创建四个不同上下文的要求与四边形最为最佳,但经过一些调整后,也可以使圆形竞技场发挥作用。
其次,应确定每个编码/测试会话之间的间隔,以便鼠每次都保持相同的兴趣水平,同时避免因密集的重复时间表而产生累积学习的风险。通常,编码和测试之间的延迟时间至少延长一倍的间隔就足够了,更长的间隔更有利于两次以上的重复。这意味着,虽然在 24 小时测试后,至少 48 小时间隔足以重复一到两次,但建议使用 1 周间隔进行四次重复。图 5 的结果和使用ANOVA的比较显示,任务可以成功地重复四次。在此基础上,已建立的协议可用于制衡多达四个实验条件。实验组的数量决定在不同上下文中编码/试验会话的重复次数。 图5 的结果是使用两个实验组协议的一种可能方法。两届会议对这些小组进行了制衡,在另外两届会议中重复了同样的条件(为了验证目的)。第二组制衡会话也可用于制衡新条件。同样,可以分别使用三到四个平衡会话比较三到四个实验条件。
在这些情况下,应设计上下文以适应协议中描述的对比特征。值得注意的是,平衡设计可能不适合使用其他操作的实验,例如可能留下长期效果或损害的药理干预。为了保持测试的有效性和可复制性,应相应地设计实验。重复测试的数据可以通过多种方式呈现和分析,如图 5所示。对于初始分析,每个上下文中的实验组可以单独比较机会水平,使用一个样本t测试来确定任何重要的偏好(图5B,D)。这有助于快速了解数据,但它只确保对组进行间接比较。因此,对于比较两个或两个以上组,应分别使用双样本t测试(配对或未修复)或 ANOVA 分析数据。这可以以单个编码/测试会话(图 4A和图 5B,D)中的组之间的主体比较或来自两个(或更多)制衡上下文的组的主体内比较的形式(图 5C,E)。强烈推荐后一种方法,尤其是在处理弱记忆条件时,如前所述,由于行为随机性,这些情况会导致高差异。
结合平衡上下文,需要更大的组以最小的变化可靠地可视化组的行为。使用在制衡会话中重复的协议,可以预期使用具有相同统计能力的单个测试所需的鼠数量将减少约三分之一。通常,在 7 到 15 只大鼠(总计)的范围内进行平衡会话,在 20 到 50 只大鼠(每组 10 到 25 只)的范围内,效果大小和功率均大于 0.8 的样本量就足够了。需要的动物数量的减少和我们使用此协议从每种动物那里获得的信息的增加,都完善了研究,并符合研究中动物伦理用途的 3R 原则。在这一步中,重要的是要记住,随机的老鼠行为,不伴有强烈的记忆力,可能会导致个人强烈的偏好低于和高于机会,但组平均应产生一个偏好,与机会没有显著区别。应仔细解释单个数据。小组中各个数据点的分布也可以为解释结果提供信息。如 图4 和 图5所见,分布会根据记忆的强度而变化。总体而言,这里提出的协议可以很容易地遵循,以实现对象定位任务与重复建模短期和/或长期空间内存。简单而灵活的培训协议以及实施进一步操作的可能性使此任务成为热门选择。对协议的这些修改使调查能够调查特定步骤,如内存获取、整合和召回。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢安东尼奥斯·阿西米纳斯、多萝西·谢、小原诚司和大卫·贝特的有见地的意见和建议。这项研究得到了伊拉斯谟®(对G.B和L.N.) 的支持;奥胡斯大学卫生研究生院(到K.H.):诺和诺德基金会青年研究员奖2017年(NNF17OC0026774),伦德贝克方登(DANDRITE-R248-2016-2518)和PROMEMO – 记忆中的蛋白质中心,由丹麦国家研究基金会(DNRF133)资助的卓越中心(T.T.)。
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |