Mekanismen forbundet med fagocytose i Leishmania-infektion forbliver dårligt forstået. Her beskriver vi metoder til at evaluere de tidlige begivenheder, der opstår under Leishmania-interaktionen med værtscellerne.
Fagocytose er en orkestreret proces, der involverer forskellige trin: anerkendelse, binding og internalisering. Professionelle fagocytter optager Leishmania-parasitter ved fagocytose, der består i at genkende ligander på parasitoverflader af flere værtscellereceptorer. Binding af Leishmania til makrofagmembraner sker gennem komplementreceptor type 1 (CR1) og komplementreceptortype 3 (CR3) og mønstergenkendelsesreceptorer. Lipophosphoglycan (LPG) og 63 kDa glycoprotein (gp63) er de vigtigste ligander involveret i makrofag-Leishmania interaktioner. Efter den første anerkendelse af parasitligander af værtscellereceptorer bliver parasitter internaliseret, overlever og formerer sig inden for parasitoforiske vakuoler. Modningsprocessen af Leishmania-inducerede vakuoler involverer erhvervelse af molekyler fra intracellulære vesikler, herunder monomert G-protein Rab 5 og Rab 7, lysosomalt associeret membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt associeret membranprotein 2 (LAMP-2) og mikrotubuli-associeret protein 1A / 1B-lyskæde 3 (LC3).
Her beskriver vi metoder til at evaluere de tidlige begivenheder, der forekommer under Leishmania-interaktion med værtscellerne ved hjælp af konfokal mikroskopi, herunder (i) binding (ii) internalisering og (iii) fagosommodning. Ved at tilføje til mængden af viden omkring disse determinanter for infektionsresultat håber vi at forbedre forståelsen af patogenesen af Leishmania-infektion og støtte den eventuelle søgning efter nye kemoterapeutiske mål.
Leishmaniasis er en forsømt tropisk sygdom forårsaget af protozoiske parasitter af slægten Leishmania, hvilket resulterer i et bredt spektrum af kliniske manifestationer hos hvirveldyrværten, herunder kutan leishmaniasis, mucokutan leishmaniasis og visceral leishmaniasis1. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) anslår, at over en milliard mennesker er i fare, med mere end en million nye tilfælde rapporteret om år2.
Leishmania spp. er obligatoriske intracellulære protozoer, der overlever inde i værtsceller, herunder monocytter, makrofager og dendritiske celler3. Leishmania-makrofaginteraktion er en kompleks proces, der involverer flere værtscellereceptorer og parasitligander enten gennem direkte interaktion eller ved opsonisering, der involverer komplementreceptorer 4,5. Klassiske overfladereceptorer, såsom CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectin, toll-lignende og scavenger receptorer, medierer parasitbinding til makrofager 6,7,8. Disse receptorer genkender molekyler på overfladen af Leishmania, herunder 63 kDa glycoprotein (gp63) og glycolipid lipophosphoglycan (LPG)9. Disse er de mest rigelige molekyler på overfladen af promastigotes og spiller en væsentlig rolle i undergravningen af værtsimmunrespons, hvilket favoriserer etableringen af parasitinfektion i pattedyrceller10. Efter at parasitoverfladeligander binder sig til makrofagreceptorer, akkumuleres F-actin på pattedyrcelleoverflader, omgivende parasitter, når de fagocytoseres. Efterfølgende fører dette til dannelsen af et parasitinduceret rum kaldet parasitophorous vakuol (PV), som præsenterer fagolysosomale træk11. En gang inde i disse fagolysomer gennemgår parasitter flere ændringer, der er afgørende for overlevelse og multiplikation3.
Biogenese af PV’er er en stærkt reguleret membranhandelsproces, der er kritisk for den intracellulære overlevelse af dette patogen12. Dannelsen af dette rum skyldes sekventielle fusionshændelser mellem fagosomer og rum i værtsendocytisk vej. Klassiske cellebiologiske undersøgelser har afsløret, at modningen af PV’er involverer erhvervelse af monomere G-protein Rab 5- og Rab 7-proteiner, som hovedsageligt er forbundet med henholdsvis tidlig og sen endosommodning13. Derudover erhverver disse rum lysosomassocierede membranproteiner 1 og 2 (LAMP 1, LAMP 2), de vigtigste proteinbestanddele i den lysosomale membran og mikrotubulusassocieret protein 1A / 1B-lyskæde 3 (LC3), en autofagosommarkør14. På trods af tilsyneladende ligheder varierer kinetikken af PV-dannelse15,16 og morfologien af disse rum afhængigt af Leishmania-arter. For eksempel inducerer infektion forårsaget af L. mexicana eller L. amazonensis dannelsen af store rum indeholdende et stort antal parasitter17. I modsætning hertil danner andre arter, såsom L. braziliensis og L. infantum, mindre vakuoler, der normalt kun indeholder en eller to parasitter i hver vakuol18.
På trods af denne viden omkring værtscelle-Leishmania-interaktion er de indledende begivenheder udløst af kontakt mellem værtsreceptorer og parasitligander ikke blevet fuldt ud belyst. Disse hændelser vides at være determinanter for resultatet af parasitinfektion og er afhængige af parasitarter, typen af værtscellereceptorer, der rekrutteres til at genkende parasitter og aktiveringen af makrofagsignaleringsveje19,20. Derfor er det vigtigt at identificere de molekyler, der er involveret i biogenesen af Leishmania-inducerede PV’er, og bestemme den eller de roller, som disse molekyler spiller i infektionsetablering og -resultat. Her beskriver vi en metode til overvågning af tidlige begivenheder, der forekommer under fagocytose af Leishmania, herunder binding, internalisering, fagosomdannelse og modning. Dette arbejde kunne hjælpe med at afklare PLC’s, Akts, Rab5s, Rab7′ og LC3’s deltagelse i dannelsen af PC’er induceret af forskellige Leishmania-arter. Det er vigtigt, at denne protokol kan bruges til at undersøge deltagelsen af andre proteiner involveret i PV-modning. Fremtidige undersøgelser vil udvide viden omkring mekanismer involveret i Leishmania-værtscelleinteraktion og bidrage til udformningen af nye kemoterapeutiske strategier.
Leishmania-makrofaginteraktion er en kompleks proces og involverer flere trin, der kan påvirke sygdomsudvikling5. For bedre at forstå de mekanismer, der er involveret i interaktionen mellem uponiserede Leishmania og værtsceller, har vi beskrevet en protokol, der anvender konfokal fluorescensmikroskopi til at vurdere fagocytose fra tidlige til sene stadier af Leishmania-infektion . Anvendelsen af fluorescensteknikker, der involverer to eller flere fluoroforer til at un…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Gonçalo Moniz Institute, Fiocruz Bahia, Brasilien og afdelingen for mikroskopi for hjælp. Dette arbejde blev støttet af INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, P.S.T.V. har en bevilling til produktivitet i forskning fra CNPq (305235/2019-2). Plasmider blev venligst leveret af Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Forfatterne vil gerne takke Andris K. Walter for engelsk oversættelse og hjælp til kopiering af manuskripter.
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
Histopaque | Sigma | 10771 | |
M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
NH4Cl | Sigma | A9434 | |
Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
Triton X-100 | Sigma | X |