Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie
Summary
Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.
Abstract
Phagozytose ist ein orchestrierter Prozess, der verschiedene Schritte umfasst: Erkennen, Binden und Verinnerlichen. Professionelle Phagozyten nehmen Leishmanien-Parasiten durch Phagozytose auf, die aus der Erkennung von Liganden auf Parasitenoberflächen durch mehrere Wirtszellrezeptoren besteht. Die Bindung von Leishmanien an Makrophagenmembranen erfolgt durch Komplementrezeptor Typ 1 (CR1) und Komplementrezeptor Typ 3 (CR3) und Mustererkennungsrezeptoren. Lipophosphoglycan (LPG) und 63 kDa Glykoprotein (gp63) sind die Hauptliganden, die an Makrophagen-Leishmanien-Interaktionen beteiligt sind. Nach der ersten Erkennung von Parasitenliganden durch Wirtszellrezeptoren werden Parasiten internalisiert, überleben und vermehren sich in parasitophoren Vakuolen. Der Reifungsprozess von Leishmanien-induzierten Vakuolen beinhaltet den Erwerb von Molekülen aus intrazellulären Vesikel, einschließlich des monomeren G-Proteins Rab 5 und Rab 7, des lysosomalen assoziierten Membranproteins 1 (LAMP-1), des lysosomalen assoziierten Membranproteins 2 (LAMP-2) und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A / 1B-Lichtkette 3 (LC3).
Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der frühen Ereignisse, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten, mittels konfokaler Mikroskopie, einschließlich (i) Bindung, (ii) Internalisierung und (iii) Phagosomenreifung. Durch die Erweiterung des Wissens über diese Determinanten des Infektionsergebnisses hoffen wir, das Verständnis der Pathogenese der Leishmanien-Infektion zu verbessern und die Suche nach neuen chemotherapeutischen Zielen zu unterstützen.
Introduction
Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die durch Protozoenparasiten der Gattung Leishmanien verursacht wird und zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen im Wirbeltierwirt führt, einschließlich kutaner Leishmaniose, mukokutaner Leishmaniose und viszeraler Leishmaniose 1. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass über eine Milliarde Menschen gefährdet sind, wobei mehr als eine Million neue Fälle pro Jahr gemeldetwerden 2.
Leishmania spp. sind obligate intrazelluläre Protozoen, die in Wirtszellen überleben, einschließlich Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen3. Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess, an dem mehrere Wirtszellrezeptoren und Parasitenliganden beteiligt sind, entweder durch direkte Interaktion oder durch Opsonisierung mit Komplementrezeptoren 4,5. Klassische Oberflächenrezeptoren wie CR1, CR3, Mannose-Fucose, Fibronektin, Toll-like- und Scavenger-Rezeptoren vermitteln die Parasitenbindung an Makrophagen 6,7,8. Diese Rezeptoren erkennen Moleküle auf der Oberfläche von Leishmania, darunter das 63 kDa-Glykoprotein (gp63) und das Glykolipid Lipophosphoglycan (LPG)9. Dies sind die am häufigsten vorkommenden Moleküle auf der Oberfläche von Promastigoten und spielen eine wesentliche Rolle bei der Subversion der Immunantwort des Wirts, was die Etablierung einer Parasiteninfektion in Säugetierzellen begünstigt10. Nachdem Parasitenoberflächenliganden an Makrophagenrezeptoren gebunden haben, reichert sich F-Aktin auf den Zelloberflächen von Säugetieren an und umgibt Parasiten, wenn sie phagozytiert werden. Anschließend führt dies zur Bildung eines parasiteninduzierten Kompartiments, das als parasitophoröse Vakuole (PV) bezeichnet wird und phagolysosomale Merkmale aufweist11. Sobald sie sich in diesen Phagolysosomen befinden, durchlaufen Parasiten mehrere Veränderungen, die für das Überleben und die Vermehrung unerlässlich sind3.
Die Biogenese von PVs ist ein stark regulierter Membrantransportprozess, der für das intrazelluläre Überleben dieses Erregers entscheidend ist12. Die Bildung dieses Kompartiments resultiert aus sequentiellen Fusionsereignissen zwischen Phagosomen und Kompartimenten des endozytären Signalwegs des Wirts. Klassische zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Reifung von PVs den Erwerb von monomeren G-Proteinen Rab 5 und Rab 7 beinhaltet, die hauptsächlich mit einer frühen bzw. späten Endosomenreifung assoziiert sind13. Zusätzlich erwerben diese Kompartimente die Lysosom-assoziierten Membranproteine 1 und 2 (LAMP 1, LAMP 2), die Hauptproteinbestandteile der lysosomalen Membran und des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1A/1B-Lichtkette 3 (LC3), einen Autophagosomenmarker14. Trotz offensichtlicher Ähnlichkeiten variieren die Kinetik der PV-Bildung15,16 und die Morphologie dieser Kompartimente je nach Leishmania-Spezies. Zum Beispiel induziert eine Infektion durch L. mexicana oder L. amazonensis die Bildung großer Kompartimente, die eine große Anzahl von Parasiten enthalten17. Im Gegensatz dazu bilden andere Arten, wie L. braziliensis und L. infantum, kleinere Vakuolen, die normalerweise nur einen oder zwei Parasiten in jeder Vakuoleenthalten 18.
Trotz dieses Wissens über die Interaktion zwischen Wirtszelle und Leishmanie sind die anfänglichen Ereignisse, die durch den Kontakt zwischen Wirtsrezeptoren und Parasitenliganden ausgelöst werden, nicht vollständig aufgeklärt. Es ist bekannt, dass diese Ereignisse Determinanten des Ergebnisses einer Parasiteninfektion sind und von der Parasitenart, der Art der Wirtszellrezeptoren, die zur Erkennung von Parasiten rekrutiert werden, und der Aktivierung von Makrophagen-Signalwegen abhängen19,20. Daher ist es wichtig, die Moleküle zu identifizieren, die an der Biogenese von Leishmanien-induzierten PVs beteiligt sind, und die Rolle(n) zu bestimmen, die diese Moleküle bei der Etablierung und dem Ergebnis von Infektionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Überwachung früher Ereignisse, die während der Phagozytose von Leishmania auftreten, einschließlich Bindung, Internalisierung, Phagosomenbildung und Reifung. Diese Arbeit könnte dazu beitragen, die Beteiligung von PLC, Akt, Rab5, Rab7 und LC3 an der Bildung von PVs zu klären, die durch verschiedene Leishmania-Arten induziert werden. Wichtig ist, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Beteiligung anderer Proteine zu untersuchen, die an der PV-Reifung beteiligt sind. Zukünftige Studien werden das Wissen über die Mechanismen der Leishmania-Wirtszellinteraktion erweitern und zur Entwicklung neuartiger chemotherapeutischer Strategien beitragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leishmanien-Makrophagen-Interaktion ist ein komplexer Prozess und umfasst mehrere Schritte, die die Krankheitsentwicklung beeinflussen können5. Um die Mechanismen der Interaktion von nicht opsonisierten Leishmanien und Wirtszellen besser zu verstehen, haben wir ein Protokoll beschrieben, das konfokale Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Phagozytose vom frühen bis zum späten Stadium der Leishmanien-Infektion zu beurteilen. Die Verwendung von Fluoreszenztechniken m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Gonçalo Moniz Institut, Fiocruz Bahia, Brasilien und der Abteilung für Mikroskopie für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INOVA-FIOCRUZ Nummer 79700287000 unterstützt, P.S.T.V. hält einen Zuschuss für Produktivität in der Forschung von CNPq (305235/2019-2). Plasmide wurden freundlicherweise von Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA, zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken Andris K. Walter für die Überarbeitung der englischen Sprache und die Unterstützung beim Manuskriptlektorat.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
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