חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
Summary
המנגנון הקשור לפאגוציטוזה בזיהום לישמניה נותר לא מובן. כאן אנו מתארים שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים.
Abstract
פאגוציטוזה היא תהליך מתוזמר הכולל שלבים נפרדים: הכרה, כריכה והפנמה. פאגוציטים מקצועיים קולטים טפילי לישמניה על ידי פאגוציטוזה, המורכבת מזיהוי ליגנדים על משטחי טפילים על ידי קולטנים מרובים של תאי מארח. קשירת לישמניה לממברנות מקרופאגים מתרחשת באמצעות קולטן משלים מסוג 1 (CR1) וקולטן משלים מסוג 3 (CR3) וקולטני זיהוי תבניות. ליפופוספוגילן (LPG) וגליקופרוטאין 63 kDa (gp63) הם הליגנדות העיקריות המעורבות באינטראקציות מקרופאג’-לישמניה . לאחר הזיהוי הראשוני של ליגנדות טפילים על ידי קולטני התאים המארחים, הטפילים מופנמים, שורדים ומתרבים בתוך טפילים. תהליך ההבשלה של ואקואולים הנגרמים על ידי לישמניה כרוך ברכישת מולקולות משלפוחיות תוך-תאיות, כולל חלבון G מונומרי Rab 5 ו-Rab 7, חלבון ממברנה הקשור לליזוזומלי 1 (LAMP-1), חלבון ממברנה הקשור לליזוזומלי 2 (LAMP-2), וחלבון הקשור למיקרוטובול 1A/1B-light chain 3 (LC3).
במאמר זה נתאר שיטות להערכת האירועים המוקדמים המתרחשים במהלך אינטראקציה של לישמניה עם התאים המארחים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, כולל (i) קישור (ii) הפנמה, ו-(iii) התבגרות פגוזום. על ידי הוספה לגוף הידע סביב גורמים אלה של תוצאות זיהום, אנו מקווים לשפר את ההבנה של הפתוגנזה של זיהום לישמניה ולתמוך בסופו של דבר בחיפוש אחר מטרות כימותרפיות חדשות.
Introduction
לישמניאזיס היא מחלה טרופית מוזנחת הנגרמת על ידי טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה, וכתוצאה מכך ספקטרום רחב של ביטויים קליניים בפונדקאי החולייתנים, כולל לישמניאזיס עורית, לישמניאזיס רירית ולישמניאזיס הקרביים1. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מעריך כי יותר ממיליארד בני אדם נמצאים בסיכון, עם יותר ממיליון מקרים חדשים המדווחים בשנה2.
לישמניה spp. הם פרוטוזואנים תוך-תאיים מחייבים ששורדים בתוך התאים המארחים, כולל מונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים3. אינטראקציה לישמניה-מקרופאגים היא תהליך מורכב הכולל קולטנים מרובים של תאים מארחים וליגנדות טפילים באמצעות אינטראקציה ישירה או על ידי אופסוניזציה המערבת קולטני משלים 4,5. קולטני פני שטח קלאסיים, כגון CR1, CR3, מנוז-פוקוז, פיברונקטין, קולטנים דמויי אגרה ונבלות, מתווכים חיבור טפילים למקרופאגים 6,7,8. קולטנים אלה מזהים מולקולות על פני השטח של לישמניה, כולל גליקופרוטאין 63 kDa (gp63) וליפופוגליקן גליקוליפיד (LPG)9. אלה הן המולקולות הנפוצות ביותר על פני השטח של promastigotes וממלאות תפקיד חיוני בחתרנות של התגובה החיסונית המארחת, לטובת הקמת זיהום טפילי בתאי יונקים10. לאחר שליגנדות פני השטח של הטפילים נקשרות לקולטני מקרופאגים, F-אקטין מצטבר על פני השטח של תאי היונקים, ומקיף את הטפילים כשהם פאגוציטוזה. לאחר מכן, זה מוביל להיווצרות של תא המושרה על ידי טפיל המכונה vacuole טפילי (PV), אשר מציג תכונות phagolysosomal11. ברגע שהם נמצאים בתוך הפאגוליסוזומים האלה, הטפילים עוברים מספר שינויים החיוניים להישרדות ולכפל3.
הביוגנזה של PVs היא תהליך מווסת מאוד של סחר בממברנה החיוני להישרדות התוך-תאית של פתוגןזה 12. היווצרותו של תא זה נובעת מאירועי איחוי רציפים בין פאגוזומים ותאים של המסלול האנדוציטי המארח. מחקרים קלאסיים בביולוגיה של התא גילו כי הבשלה של PVs כרוכה ברכישת חלבונים מונומריים מסוג G חלבון Rab 5 ו-Rab 7, הקשורים בעיקר להבשלה מוקדמת ומאוחרת של האנדוזום,בהתאמה 13. בנוסף, תאים אלה רוכשים חלבוני ממברנה הקשורים לליזוזום 1 ו-2 (LAMP 1, LAMP 2), המרכיבים החלבוניים העיקריים של הממברנה הליזוזומלית וחלבון 1A/1B-light chain 3 (LC3) הקשור למיקרוטובול, סמן אוטופגוזום14. למרות הדמיון לכאורה, הקינטיקה של היווצרות PV15,16 והמורפולוגיה של תאים אלה משתנים בהתאם למיני לישמניה. לדוגמה, זיהום הנגרם על ידי L. mexicana או L. amazonensis גורם להיווצרות של תאים גדולים המכילים מספר רב של טפילים17. לעומת זאת, מינים אחרים, כגון L. braziliensis ו– L. infantum, יוצרים vacuoles קטנים יותר המכילים בדרך כלל רק טפיל אחד או שניים בכל vacuole18.
למרות הידע הזה סביב האינטראקציה בין התא המארח ללישמניה, האירועים הראשוניים המופעלים על ידי מגע בין קולטני פונדקאי לליגנדות טפילים לא הובהרו במלואם. אירועים אלה ידועים כגורמים הקובעים את תוצאות ההדבקה בטפילים והם תלויים במיני טפילים, בסוג הקולטנים של תאי המארח שגויסו לזיהוי טפילים ובהפעלת מסלולי איתות מקרופאגים19,20. לכן, חיוני לזהות את המולקולות המעורבות בביוגנזה של PVs הנגרמים על ידי לישמניה ולקבוע את התפקידים שממלאות מולקולות אלה בהתבססות הזיהום ובתוצאותיו. במאמר זה נתאר שיטה לניטור אירועים מוקדמים המתרחשים במהלך הפאגוציטוזה של לישמניה, כולל קשירה, הפנמה, היווצרות פאגוסומים והבשלה. עבודה זו יכולה לסייע בהבהרת השתתפותם של PLC, Akt, Rab5, Rab7 ו- LC3 בהיווצרות PVs המושרים על ידי מיני לישמניה שונים. חשוב לציין שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את השתתפותם של חלבונים אחרים המעורבים בהבשלת PV. מחקרים עתידיים ירחיבו את הידע סביב מנגנונים המעורבים באינטראקציה בין לישמניה לתא המארח ויתרמו לתכנון אסטרטגיות כימותרפיות חדשניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציה בין לישמניה-מקרופאגים היא תהליך מורכב וכולל מספר שלבים שיכולים להשפיע על התפתחות המחלה5. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המעורבים באינטראקציה של לישמניה לא מנוצלת ותאים מארחים, תיארנו פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי להעריך פאגו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למכון גונסאלו מוניז, פיוקרוז באהיה, ברזיל ולמחלקת המיקרוסקופיה על הסיוע. עבודה זו נתמכה על ידי INOVA-FIOCRUZ מספר 79700287000, P.S.T.V. מחזיקה במענק לפרודוקטיביות במחקר מ- CNPq (305235/2019-2). פלסמידים סופקו בחביבות על ידי מאוריציו טרביזניק, אוניברסיטת טורונטו, קליפורניה. המחברים רוצים להודות לאנדריס ק. וולטר על התיקון בשפה האנגלית ועל הסיוע בהעתקת כתבי יד.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
