Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale
Summary
Il meccanismo associato alla fagocitosi nell’infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l’interazione di Leishmania con le cellule ospiti.
Abstract
La fagocitosi è un processo orchestrato che coinvolge fasi distinte: riconoscimento, legame e internalizzazione. I fagociti professionali assorbono i parassiti della Leishmania mediante fagocitosi, consistente nel riconoscere i ligandi sulle superfici dei parassiti da più recettori delle cellule ospiti. Il legame della Leishmania alle membrane dei macrofagi avviene attraverso il recettore del complemento di tipo 1 (CR1) e il recettore del complemento di tipo 3 (CR3) e i recettori di riconoscimento dei pattern. Il lipofosfoglicano (LPG) e la glicoproteina 63 kDa (gp63) sono i principali ligandi coinvolti nelle interazioni macrofago-Leishmania . Dopo il riconoscimento iniziale dei ligandi del parassita da parte dei recettori delle cellule ospiti, i parassiti si internalizzano, sopravvivono e si moltiplicano all’interno dei vacuoli parassitoforici. Il processo di maturazione dei vacuoli indotti da Leishmania comporta l’acquisizione di molecole da vescicole intracellulari, tra cui la proteina G monomerica Rab 5 e Rab 7, la proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP-1), la proteina di membrana associata lisosomiale 2 (LAMP-2) e la proteina 1A/1B-catena leggera 3 associata ai microtubuli (LC3).
Qui, descriviamo i metodi per valutare i primi eventi che si verificano durante l’interazione della Leishmania con le cellule ospiti usando la microscopia confocale, incluso (i) legame (ii) internalizzazione e (iii) maturazione dei fagosomi. Aggiungendo al corpo di conoscenze che circondano questi determinanti dell’esito dell’infezione, speriamo di migliorare la comprensione della patogenesi dell’infezione da Leishmania e sostenere l’eventuale ricerca di nuovi bersagli chemioterapici.
Introduction
La leishmaniosi è una malattia tropicale trascurata causata da protozoi parassiti del genere Leishmania, che provoca un ampio spettro di manifestazioni cliniche nell’ospite vertebrato, tra cui la leishmaniosi cutanea, la leishmaniosi mucocutanea e la leishmaniosi viscerale1. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima che oltre un miliardo di persone siano a rischio, con oltre un milione di nuovi casi segnalati ogni anno2.
Leishmania spp. sono protozoi intracellulari obbligati che sopravvivono all’interno delle cellule ospiti, inclusi monociti, macrofagi e cellule dendritiche3. L’interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso che coinvolge più recettori delle cellule ospiti e ligandi parassiti sia attraverso l’interazione diretta che per opsonizzazione che coinvolge i recettori del complemento 4,5. I recettori di superficie classici, come CR1, CR3, mannosio-fucosio, fibronectina, recettori toll-like e scavenger, mediano l’attaccamento del parassita ai macrofagi 6,7,8. Questi recettori riconoscono le molecole sulla superficie della Leishmania, tra cui la glicoproteina 63 kDa (gp63) e il glicolipide lipofosfoglicano (LPG)9. Queste sono le molecole più abbondanti sulla superficie dei promastigoti e svolgono un ruolo essenziale nella sovversione della risposta immunitaria dell’ospite, favorendo l’instaurarsi dell’infezione parassitaria nelle cellule di mammifero10. Dopo che i ligandi superficiali del parassita si legano ai recettori dei macrofagi, la F-actina si accumula sulle superfici cellulari dei mammiferi, circondando i parassiti mentre sono fagocitati. Successivamente, questo porta alla formazione di un compartimento indotto dal parassita chiamato vacuolo parassitoforo (PV), che presenta caratteristiche fagolisosomiali11. Una volta all’interno di questi fagolisosomi, i parassiti subiscono diverse alterazioni essenziali per la sopravvivenza e la moltiplicazione3.
La biogenesi dei PV è un processo di traffico di membrana altamente regolato critico per la sopravvivenza intracellulare di questo patogeno12. La formazione di questo compartimento deriva da eventi di fusione sequenziale tra fagosomi e compartimenti della via endocitica dell’ospite. Studi classici di biologia cellulare hanno rivelato che la maturazione dei PV comporta l’acquisizione delle proteine monomeriche G Rab 5 e Rab 7, che sono principalmente associate alla maturazione precoce e tardiva dell’endosoma, rispettivamente13. Inoltre, questi compartimenti acquisiscono le proteine di membrana associate ai lisosomi 1 e 2 (LAMP 1, LAMP 2), i principali costituenti proteici della membrana lisosomiale e la proteina 1A/1B-catena leggera associata ai microtubuli (LC3), un marcatore autofagosomico14. Nonostante apparenti somiglianze, la cinetica della formazione PV15,16 e la morfologia di questi compartimenti variano a seconda delle specie di Leishmania. Ad esempio, l’infezione causata da L. mexicana o L. amazonensis induce la formazione di grandi compartimenti contenenti un gran numero di parassiti17. Al contrario, altre specie, come L. braziliensis e L. infantum, formano vacuoli più piccoli che normalmente contengono solo uno o due parassiti in ogni vacuolo18.
Nonostante questa conoscenza che circonda l’interazione cellula ospite-Leishmania, gli eventi iniziali innescati dal contatto tra i recettori dell’ospite e i ligandi dei parassiti non sono stati completamente chiariti. Questi eventi sono noti per essere determinanti dell’esito dell’infezione parassitaria e dipendono dalle specie di parassiti, dal tipo di recettori delle cellule ospiti reclutati per riconoscere i parassiti e dall’attivazione delle vie di segnalazione dei macrofagi19,20. Pertanto, è essenziale identificare le molecole coinvolte nella biogenesi dei PV indotti da Leishmania e determinare il ruolo svolto da queste molecole nell’instaurazione e nell’esito dell’infezione. Qui, descriviamo un metodo di monitoraggio degli eventi precoci che si verificano durante la fagocitosi della Leishmania, tra cui il legame, l’internalizzazione, la formazione e la maturazione dei fagosomi. Questo lavoro potrebbe aiutare a chiarire la partecipazione di PLC, Akt, Rab5, Rab7 e LC3 nella formazione di PV indotti da diverse specie di Leishmania. È importante sottolineare che questo protocollo può essere utilizzato per studiare la partecipazione di altre proteine coinvolte nella maturazione del PV. Studi futuri amplieranno le conoscenze sui meccanismi coinvolti nell’interazione Leishmania-cellula ospite e contribuiranno alla progettazione di nuove strategie chemioterapiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’interazione Leishmania-macrofagi è un processo complesso e comporta diversi passaggi che possono influenzare lo sviluppo della malattia5. Per comprendere meglio i meccanismi coinvolti nell’interazione tra Leishmania non opisonizzata e cellule ospiti, abbiamo descritto un protocollo che impiega la microscopia a fluorescenza confocale per valutare la fagocitosi dalle fasi iniziali a quelle tardive dell’infezione da Leishmania. L’uso di tecniche di fluorescenza che coinv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo l’Istituto Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brasile e il dipartimento di microscopia per l’assistenza. Questo lavoro è stato supportato dal numero 79700287000 di INOVA-FIOCRUZ, P.S.T.V. detiene una sovvenzione per la produttività nella ricerca da CNPq (305235 / 2019-2). I plasmidi sono stati gentilmente forniti da Mauricio Terebiznik, Università di Toronto, CA. Gli autori desiderano ringraziare Andris K. Walter per la revisione in lingua inglese e l’assistenza per il copyediting del manoscritto.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Referências
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