共焦点顕微鏡を用いた リーシュマニア の貪食作用の調査
Summary
リーシュマニア感染における貪食作用に関連するメカニズムは、ほとんど解明されていないままである。ここでは、リーシュマニアと宿主細胞との相互作用の間に起こる初期事象を評価する方法について説明する。
Abstract
貪食作用は、認識、結合、および内在化という別個のステップを含む、調整されたプロセスです。プロの貪食細胞は、複数の宿主細胞受容体によって寄生虫表面上のリガンドを認識することからなる、貪食作用によって リーシュマニア 寄生虫を取り込む。 リーシュマニア のマクロファージ膜への結合は、補体受容体1型(CR1)および補体受容体3型(CR3)およびパターン認識受容体を介して起こる。リポホスホグリカン(LPG)および63kDa糖タンパク質(gp63)は、マクロファージ-リーシュマニア 相互作用に関与する主なリガンドである。宿主細胞受容体による寄生虫リガンドの最初の認識に続いて、寄生虫は内在化し、生存し、寄生性液胞内で増殖する。 リーシュマニア誘発液胞の成熟過程は、単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7、リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP-1)、リソソーム関連膜タンパク質2(LAMP-2)、および微小管関連タンパク質1A/1B-軽鎖3(LC3)を含む細胞内小胞からの分子の獲得を含む。
ここでは、(i)結合(ii)インターナリゼーション、および(iii)ファゴソーム成熟を含む、共焦点顕微鏡法を用いて宿主細胞との リーシュマニア 相互作用中に生じる初期事象を評価する方法について説明する。感染転帰のこれらの決定要因を取り巻く知識体系に追加することにより、 我々はリーシュマニア 感染の病因の理解を改善し、新規化学療法標的の最終的な探索を支援することを望んでいる。
Introduction
リーシュマニア症は、 リーシュマニア属の原生動物寄生虫によって引き起こされる顧みられない熱帯病であり、脊椎動物宿主において、皮膚リーシュマニア症、皮膚粘膜リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症を含む広範囲の臨床症状をもたらす1。世界保健機関(WHO)は、10億人以上の人々が危険にさらされており、年間100万人以上の新規症例が報告されていると推定しています2。
リーシュマニア属菌は、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む宿主細胞内で生存する義務性細胞内原生動物である3。リーシュマニア-マクロファージ相互作用は、直接相互作用を介して、または補体受容体を含むオプソニゼーションによって、複数の宿主細胞受容体および寄生虫リガンドを含む複雑なプロセスである4,5。CR1、CR3、マンノースフコース、フィブロネクチン、トール様およびスカベンジャー受容体などの古典的な表面受容体は、マクロファージへの寄生虫付着を媒介する6、7、8。これらの受容体は、63kDa糖タンパク質(gp63)および糖脂質リポホスホグリカン(LPG)9を含むリーシュマニアの表面上の分子を認識する。これらは、プロマスチゴテスの表面上で最も豊富な分子であり、宿主免疫応答の転覆に不可欠な役割を果たし、哺乳動物細胞における寄生虫感染の確立を促進する10。寄生虫表面リガンドがマクロファージ受容体に結合すると、F-アクチンは哺乳類の細胞表面に蓄積し、寄生虫が貪食されるにつれて寄生虫を取り囲む。続いて、これは寄生刺激性液胞(PV)と呼ばれる寄生虫誘発区画の形成をもたらし、これはファゴリソソームの特徴11を提示する。これらのファゴリソソームの内部に入ると、寄生虫は生存と増殖に不可欠ないくつかの変化を経験する3。
PVの生合成は、この病原体の細胞内生存に不可欠な高度に調節された膜輸送プロセスである12。このコンパートメントの形成は、宿主エンドサイトーシス経路のファゴソームとコンパートメントとの間の逐次的な融合事象から生じる。古典的な細胞生物学研究は、PVの成熟が単量体Gタンパク質Rab 5およびRab 7タンパク質の獲得を含むことを明らかにしており、これらはそれぞれ初期および後期エンドソーム成熟にそれぞれ関連している13。さらに、これらの区画は、リソソーム膜の主要タンパク質構成成分であるリソソーム関連膜タンパク質1および2(LAMP 1、LAMP 2)およびオートファゴソームマーカー14である微小管関連タンパク質1A/1B軽鎖3(LC3)を獲得する。明らかな類似性にもかかわらず、PV形成15,16の動態およびこれらの区画の形態は、リーシュマニア種によって異なる。例えば、L. mexicanaまたはL. amazonensisによって引き起こされる感染は、多数の寄生虫を含む大きな区画の形成を誘導する17。対照的に、L. braziliensisやL. infantumなどの他の種は、通常、各液胞に1つまたは2つの寄生虫のみを含むより小さな液胞を形成する18。
宿主細胞とリーシュマニア の相互作用に関するこの知識にもかかわらず、宿主受容体と寄生虫リガンドとの間の接触によって引き起こされる初期事象は完全には解明されていない。これらの事象は、寄生虫感染の結果の決定因子であることが知られており、寄生虫種、寄生虫を認識するために動員される宿主細胞受容体のタイプ、およびマクロファージシグナル伝達経路の活性化に依存する19、20。したがって、 リーシュマニア誘発PVの生合成に関与する分子を同定し、感染の確立および転帰においてこれらの分子が果たす役割を決定することが不可欠である。ここでは、結合、内在化、ファゴソーム形成および成熟を含む、 リーシュマニアの貪食作用の間に起こる初期事象をモニターする方法について説明する。この研究は、異なる リーシュマニア 種によって誘導されるPVの形成におけるPLC、Akt、Rab5、Rab7およびLC3の関与を明らかにするのに役立つ可能性がある。重要なことに、このプロトコルは、PV成熟に関与する他のタンパク質の関与を調査するために使用することができる。今後の研究は、 リーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムに関する知識を広げ、新しい化学療法戦略の設計に貢献するでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
リーシュマニアとマクロファージの相互作用は複雑なプロセスであり、疾患の発症に影響を与える可能性のあるいくつかのステップを伴います5。オプソニン化されていないリーシュマニアと宿主細胞の相互作用に関与するメカニズムをよりよく理解するために、我々は、共焦点蛍光顕微鏡法を用いてリーシュマニア感染の初期段階から後期段階までの貪食作用…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonçalo Moniz Institute、Fiocruz Bahia、ブラジル、顕微鏡検査部門の支援に感謝します。この研究は、INOVA-FIOCRUZ番号79700287000によって支援され、P.S.T.V.はCNPq(305235/2019-2)から研究における生産性のための助成金を保持しています。プラスミドは、カリフォルニア州トロント大学のMauricio Terebiznikによって親切に提供されました。著者らは、英語の改訂と原稿のコピーエディットの支援について、Andris K. Walter 氏に感謝します。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
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