Detta protokoll beskriver en icke-invasiv metod för att effektivt identifiera S-fasceller för mikroskopistudier nedströms, såsom mätning av DNA-reparationsproteinrekrytering genom lasermikrålning.
DNA-skadereparation upprätthåller cellernas genetiska integritet i en mycket reaktiv miljö. Celler kan ackumulera olika typer av DNA-skador på grund av både endogena och exogena källor som metabolisk aktivitet eller UV-strålning. Utan DNA-reparation äventyras cellens genetiska kod, vilket undergräver proteinens strukturer och funktioner och potentiellt orsakar sjukdom.
Att förstå den spatiotemporala dynamiken i de olika DNA-reparationsvägarna i olika cellcykelfaser är avgörande inom DNA-skadereparation. Nuvarande fluorescerande mikroskopitekniker ger bra verktyg för att mäta rekryteringskinetiken för olika reparationsproteiner efter DNA-skada induktion. DNA-syntes under cellcykelns S-fas är en märklig punkt i cellens öde när det gäller DNA-reparation. Det ger ett unikt fönster för att screena hela genomet för misstag. Samtidigt utgör DNA-syntesfel också ett hot mot DNA-integriteten som inte påträffas i icke-dela celler. Därför skiljer sig DNA-reparationsprocesserna avsevärt i S-fas jämfört med andra faser av cellcykeln, och dessa skillnader är dåligt förstådda.
Följande protokoll beskriver beredning av cellinjer och mätning av dynamiken hos DNA-reparationsproteiner i S-fas på lokalt inducerade DNA-skadeplatser, med hjälp av ett laserskanningskonfokalt mikroskop utrustat med en 405 nm laserlinje. Märkt PCNA (med mPlum) används som cellcykelmarkör kombinerat med ett AcGFP-märkt reparationsprotein av intresse (dvs EXO1b) för att mäta DNA-skaderekryteringen i S-fas.
Flera DNA-reparationsvägar har utvecklats för att ta itu med de olika typer av DNA-lesioner som kan uppstå i celler, som alla är starkt reglerade i både tid och rum. En av de mest sårbara perioderna i cellcykeln är S-fasen, när DNA-syntes uppstår. Även om spridning är grundläggande för livet utgör det också en stor utmaning. Celler måste säkerställa trofast replikation av sitt arvsmassa för att undvika mutationer som ska överföras till framtida generationer. Följaktligen ger spridning en terapeutisk interventionspunkt som har använts för utveckling av terapeutiska metoder inom onkologiområdet.
Alla de viktigaste teknikerna som används för att studera proteinrekrytering vid DNA-lesioner har sina styrkor och begränsningar. Mikrostrålning har bättre rumslig och temporal upplösning1 än de flesta alternativa metoder som immunofluorescerande avbildning av joniserande strålningsinducerade högborgar (IRIF), kromatinimmunprecipitation (ChIP) eller biokemisk fraktionering. Mikro bestrålning är dock robustheten hos ovannämnda tekniker som kan ta prov på ett stort antal celler samtidigt.
För att undersöka DNA-reparation i S-fas måste man kunna urskilja S-fasceller i en asynkron cellkulturpopulation. Det finns många välkända metoder för att ta itu med detta, som antingen omfattar synkronisering av celler eller visualisering av de olika cellcykelfaserna. Båda tillvägagångssätten medför dock betydande utmaningar och möjliga artefakter. Kemiska synkroniseringsmetoder som ofta används för att berika celler i tidig S-fas (t.ex. dubbla tymidinblock, aphidicolin och hydroxyureabehandling) uppnår synkronisering genom induktion av replikeringsstress och så småningom DNA-skada själv. Detta begränsar användningen av dessa metoder för att studera DNA-reparationsprocesser i S fas2. Synkronisering genom serum svält och frisättning är endast tillämpligt på ett begränsat antal cellinjer, till stor del exklusive cancer cellinjer som förlitar sig mindre på tillväxtfaktorer för cellcykel progression jämfört med icke-omvandlade cellinjer. Fluorescens Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) system är ett särskilt användbart verktyg för att studera cellcykeln, men det har en grundläggande begränsning vid differentiering mellan S- och G2-cellcykelfaser3.
Här visas att användning av fluorescerande märkt PCNA som en icke-invasiv markör för S-fas begränsar nackdelarna med kemiska cellcykelsynkroniseringsmetoder, samtidigt som det möjliggör mer specificitet och flexibilitet än FUCCI-systemet. Som en enda markör kan PCNA inte bara markera S-fasceller i en asynkron population, utan det kan också visa den exakta utvecklingen av celler inom S-fasen (dvs. tidig, mitten eller sen S-fas)4. Låga uttrycksnivåer av exogena, taggade PCNA säkerställer minimal interferens med både cellcykelprogression och DNA-reparationsprocesser. Viktigt är att PCNA också fungerar som en intern kontroll för korrekt DNA-skada induktion eftersom det är involverat i reparation av flera DNA-skador och rekryteras till lokalt inducerade DNA-skadeplatser1,4.
De experiment som presenteras här visar hur man mäter rekryteringsdynamiken hos EXO1b i S-fas och hur detta påverkas av den väletablerade PARP-hämmaren olaparib. EXO1b nukleasaktivitet är relevant för ett brett spektrum av DNA-reparationsvägar, inklusive felmatchning reparation (MMR), nukleotid excision reparation (NER) och dubbelsträngad paus (DSB) reparation. I S-fas spelar EXO1b en viktig roll i homolog rekombination (HR) genom bildandet av 3′ ssDNA-överhäng under DNA-samband5. EXO1b har varit ytterligare inblandad i DNA-replikering med roller i kontrollpunktsaktivering för att starta om avstannade DNA-gafflar samt primerborttagning och Okazaki fragmentmognad vid den eftersläpande strängen under strandförskjutning ireplikering 5. EXO1b-rekrytering till skadade DNA-platser regleras av den direkta interaktionen med poly (ADP-ribose) (PAR)6,7. På grund av de många cellcykelspecifika konsekvenserna av EXO1b är det ett utmärkt val för S-fasspecifika rekryteringsstudier med PCNA.
Kritiska steg och felsökning/modifieringar av potentiella protokoll
Korrekt vävnadskulturkärl för mikrostrålning är avgörande för framgång. De flesta högupplösta bildsystem är optimerade för 0,17 mm täckglastjocklek. Att använda bildkammare med högre eller lägre tjocklek eller sådana tillverkade av plastpolymerer (inte optimerade för 405 nm avbildning) kan avsevärt minska bildkvaliteten. När du använder glasytor, se till att de är vävnadskultur behandlade för att förbättra cellens vidhäftning. Om de inte behandlas med vävnadskultur måste dessa kamrar beläggas, till exempel med poly-D-lysin innan cellerna sås. Vid plätering av celler i det kammade täckglaset är idealisk celltäthet av största vikt för att undvika oegentligheter i cellcykeln och ytterligare stress i cellerna. Korrekt termisk jämvikt av mikroskopkomponenterna före experiment för att upprätthålla en stabil temperatur är avgörande för att både upprätthålla fokus under hela tidsfördröjningen och är också nödvändig för att säkerställa ett homogent DDR över tid och prover.
Det är viktigt att cellerna är i ett hälsosamt tillstånd före mikrostrålning för att minska artefaktuella data. Om celler har oregelbunden morfologi efter infektion/markering, låt cellerna gå igenom flera passager tills morfologin återgår till det normala. Se alltid till att de celler som används är fria från mykoplasmaförorening. Bland de många negativa effekterna av mykoplasmainfektion orsakar det också DNA-skador på värdcellerna och kan påverka derasDDR-vägar 14,15. Det känsligaste sättet att upptäcka mykoplasma i cellkulturen är genom PCR (jämfört med detektering med DAPI eller Hoechst).
Optimal överuttryck av reparationsproteinet av intresse bör vara jämförbart med endogena nivåer, men tillräckligt hög för detektion. Promotorn som används på virusvektorerna, virustitern under infektionen och infektionstidens längd kan alla justeras för idealiska uttrycksnivåer. För konsekventa resultat isolerar du enskilda cellkloner för att säkerställa homogena uttrycksnivåer och normal cellmorfologi. Det rekommenderas att använda vektorkonstruktioner som inte överuttrycker taggade PCNA på högre än endogena nivåer för korrekt cellcykel- och DNA-reparationsmarkörfunktion. Även låga nivåer av PCNA överuttryck är tillräckliga för att diskriminera S-fas celler. Retrovirala pBABE-vektorer har framgångsrikt använts för detta ändamål (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA kan märkas med alla monomeriska röda(t.ex. mPlum, mCherry, mRuby, etc.) eller monomeriska gröna fluorescerande proteiner (t.ex. mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) som sedan kan kombineras med en växelvis märkt POI. Att överuttrycka en fluorescerande taggad POI har vissa begränsningar och överväganden. Fluorescerande taggar kan störa normal proteinfunktion och lokalisering. Således måste taggens placering (N eller C-terminal) beaktas. Använd alltid monomeriska fluorescerande proteiner, eftersom oligomerisering av icke-monomeriska varianter kan påverka POI: s funktion.
Laserinställningarna måste bestämmas för varje bildsystem eftersom många komponenter i den optiska banan kommer att påverka den faktiska effekt som levereras till cellerna. Laser mikrostrålning kan orsaka flera typer av DNA-skador beroende på excitation våglängd, uteffekten av FRAP laser och om några pre-sensibiliserande medel (som Bromodeoxyuridine eller Hoechst) användes. 405 nm lasrar kan orsaka oxidativ DNA-skada, enkla och dubbla strandadebrott 16,17. Genom att använda högre laserutgångsinställningar ökar mängden DSB. I detta protokoll användes inte pre-sensibiliseringsmetoder, men dessa tekniker är kraftigt täckta i litteraturen och omappade i diskussionen nedan. Enligt vår mening är det bästa sättet att testa om den önskade lesionen genereras genom att testa för rekrytering av kända DNA-skador utbildningsavsnitt specifika gener. Rekrytering av NTHL1 eller OGG1, komponenter i BER-vägen, tyder på induktion av oxiderade DNA-baser10,11,17,18,19, medan FBXL10 eller XRCC5 indikerar närvaron av DSB8,20,21. Rekrytering av XRCC1 kan indikera både förekomsten av oxiderade DNA-baser och enstaka strandade pauser (SSB)22,23. XPC (dvs. RAD4) är en bra indikator på NER som tar bort de skrymmande DNA-kanalerna som genereras av ultraviolett ljus (UV)17,24. Eftersom rekrytering exogena proteiner kan införa vissa oegentligheter, immunfluorescerande färgning av endogena DNA reparation proteiner eller markörer (som γH2A.X för dubbla strandade pauser) kan bekräfta förekomsten av specifika DNA-skador. Alternativt kan antikroppar som höjs mot specifika typer av DNA-lesioner också användas. För att justera den levererade lasereffekten kan både uppehållstiden och lasereffekten ändras.
Med hjälp av matematisk modellering kan en detaljerad kinetisk analys utföras som kan ge värdefulla insikter om POI:s rekryteringsegenskaper (t.ex. bidrag från flera DNA-bindande domäner, känslighet för olika signalhändelser etc.). Automatiserad rekryteringsutvärdering och cellspårning kan kombineras för att skapa robusta arbetsflöden 1,25.
Fördelar och begränsningar av DNA-presensibilisering
Presensibilisering av DNA före mikrostrålning är ett vanligt verktyg för DNA-reparation av proteinrekrytering16,17. Sensibiliserande DNA före mikrostrålning gör det mer mottagligt för DSB. De två vanligaste metoderna för DNA-presensibilisering är förbehandling av celler med antingen Bromodeoxyuridin (BrdU) eller Hoechst färgämne. För system som inte kan mikrostråla vid höga laserkrafter kan dessa metoder vara nödvändiga för att inducera DNA-lesioner som DSB. Dessutom, i avsaknad av en överförd ljusdetektor eller en fluorescerande signal som belyser cellkärnan (till exempel när man studerar rekrytering av ouppklarade endogena DNA-reparationsproteiner), fungerar Hoechst både som ett förkänsligt verktyg och en fluorescerande nukleär fläck. DNA pre-sensibilisering kan dock införa betydande komplikationer. BrdU (som används vid en slutlig koncentration på 10 μM) måste tillsättas celler 24 timmar (eller tid som motsvarar en fullständig cellcykel i den använda cellinjen) för att korrekt införlivas i DNA och kan orsaka cellcykelstörningar26. Hoechst 33342 (används vid en slutlig koncentration av 1 μg/ml) är cytotoxisk efter långa inkubationstider men kräver tillräckligt med tid för att mätta kärnan med färgämnet. Därför bör den endast appliceras 15-20 minuter före mikrostrålning. Annars kommer rekryteringsuppgifterna inte att vara konsekventa. Cellerna som färgas på detta sätt kan inte hållas i kultur i mer än några timmar27,28. Se till att inte använda Hoechst 33358, som inte är lika cellpermeabel som Hoechst 33342 färgämne. Pre-sensibilisering kan också införa onödig varians bland experiment och gör experimentet ännu känsligare för skillnader i celltäthet (eftersom detta kommer att påverka mängden inkorporerat färgämne / cell).
Fördelar och begränsningar av konfokal mikroskopi
Bildhastigheten för konfokal mikroskopi kan vara begränsande jämfört med widefieldmikroskopi. Ett konfokalt mikroskop utrustat med en resonansskanner kan dock avsevärt förbättra bildhastigheten (på bekostnad av upplösningen) som närmar sig hastigheter för spinndiskmikroskopi. Tre funktioner gör A1R HD25 confocal-systemet till ett utmärkt val för protokollet som presenteras här. För det första gör systemets 25 mm FOV det möjligt att avbilda mellan 15-20 celler i ett enda skannat fält (jämfört med 5-10 celler i regelbundna inställningar), vilket begränsar antalet förvärv som krävs för att få tillräckligt med celler för statistisk analys. För det andra gör FRAP-modulen och två scanheads det möjligt att avbilda och mikrostråla cellerna samtidigt, inte bara sekventiellt. Slutligen ger flexibiliteten i att ha både resonans- och galvanoskannrarna möjligheten att enkelt växla mellan högupplöst bildbehandling med exceptionell hastighet som minimerar släckning av fluorforer och högupplöst bildbehandling med hög rumslig upplösning som använder långsammare skanningshastigheter för att producera bilder med ett högre signal-till-brusförhållande. Medan det använda systemet tillät ovannämnda flexibilitet, för att likna mer allmänt tillgängliga konfokala mikroskopkonfigurationer, användes endast galvanoskannern i de presenterade experimenten (för både mikrostrålning och efterföljande avbildning).
Fördelar och begränsningar av mikro bestrålning
Även om mikrostrålning ger oöverträffad rumslig och temporal upplösning, är det inte utan begränsningar. DNA-skador genom lasermikrostrålning är mycket grupperade med specifika delar av kärnan jämfört med naturligt förekommande skadliga medel. Kromatinsvar på grund av mikrostrålning kan således skilja sig åt jämfört med homogent fördelade skador. Dessutom är mikrostrålning tidskrävande och kan endast utföras på några dussin celler, medan stora populationsbaserade biokemiska metoder (kromatinfraktion, immunprecipitation, ChIP) kan ge ökad robusthet genom att studera tusentals celler åt gången. Att verifiera observationer gjorda genom mikrostrålning med traditionella biokemiska tekniker är en effektiv strategi för tillförlitliga slutsatser. Även om samtidig mikrostrålning av många celler i en viss FOV är möjlig, behöver bildsystemet mer tid för att utföra uppgiften. Att mäta dynamiken hos proteiner som rekryterar mycket snabbt till DNA-lesioner begränsar därför antalet möjliga ROI för mikrostrålning som används samtidigt. På det bildsystem som används för detta protokoll tar mikrostrålningen av en enda 1024 pixel lång ROI 1032 ms med 1000 μs uppehållstid och 3088 ms med 3000 μs uppehållstid att slutföra. Att använda flera rader av ROI ökar avsevärt den tid som behövs för att avsluta mikrostrålning (t.ex. 7 x 1024 pixel lång ROI tar 14402 ms med 1000 μs uppehållstid och 21598 ms med 3000 μs uppehållstid). Denna tid går förlorad från bildförvärv och måste beaktas. Vid snabb rekrytering av bilder, använd kortast möjliga ROI och endast mikrostråla en cell i taget.
Fördelar och begränsningar jämfört med synkroniseringsmetoder
För cellcykelspecifika studier innebär de befintliga metoderna antingen synkronisering av celler i specifika cellcykelfaser eller användning av fluorescerande reportrar för att identifiera cellens specifika cellcykelfas. Var och en av dessa metoder ger dock sina egna utmaningar och begränsningar.
FUCCI-systemet3 (som förlitar sig på fluorescerande proteinmärkta trunkerade former av CDT1 och Geminin) är ett särskilt användbart verktyg för cellcykelstudier men har begränsningar när det gäller att skilja mellan S- och G2-faser i cellcykeln. Gemininnivåerna är redan höga från mitten av S-fasen och förblir höga fram till M-fasen, vilket gör dessa faser svåra att separera. Att använda FUCCI-systemet innebär också att två optiska kanaler i mikroskopet inte kan användas för avbildning av POI.
Icke-cancer cellinjer kan synkroniseras till G0 genom avlägsnande av tillväxtfaktorer som finns i serumet (serum svält) orsakar liten eller ingen DNA-skada på cellerna. De flesta cancercelllinjer kommer dock delvis att fortsätta att utvecklas genom cellcykeln även utan tillräckliga mängder serum i sina medier. Dessutom börjar celler delvis förlora synkroniseringen i slutet av G1, tidig S-fas. Förutom serum svält finns det många kemiska metoder för att uppnå cellcykelsynkronisering. Hydroxyurea, aphidicolin och tymidinblock är metoder för att stoppa DNA-replikation för att synkronisera celler i tidig S-fas. Även om dessa metoder är billiga och enkla, introducerar de replikeringsstress som resulterar i DNA-skador. Dessa DNA-replikationshämmare har visat sig inducera fosforylering av H2A. X, en välkänd markör för DSB2,29. Metoden att använda taggad-PCNA som markör för S-fasceller minskar potentialen för artefakter orsakade av kemisk synkronisering och kan appliceras på ett brett spektrum av cellinjer jämfört med serum svält.
Slutsats
DNA-skador är en drivkraft för genetiska sjukdomar där mutagena lesioner kan leda till malign omvandling av celler. Att rikta in sig på DNA-syntesmaskineriet är en grundläggande terapeutisk strategi vid behandling av hyperproliferativa sjukdomar som cancer. För att behandla dessa sjukdomar på ett mer målinriktat sätt behöver vi en bättre förståelse för de proteiner som reparerar DNA-lesioner. Protokollet som beskrivs här hjälper mikrostrålningsbaserade studier i S-fas genom att minimera de utmaningar som traditionella synkroniseringsmetoder innebär för att minska möjliga artefakter och öka experimentens reproducerbarhet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar M. Pagano för hans kontinuerliga stöd samt D. Simoneschi, A. Marzio och G. Tang för deras kritiska granskning av manuskriptet. B. Miwatani-Minter tackar R. Miwatani och B. Minter för deras fortsatta stöd. G. Rona tackar K. Ronane Jurasz och G. Rona för deras fortsatta stöd.
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |