एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी पर Hemodynamic तनाव के प्रभाव मॉडलिंग
Summary
यहां हम ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी पर हीमोडायनामिक तनाव के प्रभाव को मॉडल करने के लिए निलंबन में कैंसर कोशिकाओं को तरल पदार्थ कतरनी तनाव लागू करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
मेटास्टेसिस के दौरान, एपिथेलिया सहित ठोस ऊतकों से कैंसर कोशिकाएं, लिम्फेटिक और हेमेटोजेनस परिसंचरण तक पहुंच प्राप्त करती हैं जहां वे हीमोडायनामिक प्रवाह के कारण यांत्रिक तनाव के संपर्क में आते हैं। इन तनावों में से एक है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) अनुभव तरल पदार्थ कतरनी तनाव (FSS) है । जबकि कैंसर कोशिकाओं को इंटरस्टिशियल प्रवाह के कारण ट्यूमर के भीतर एफएसएस के निम्न स्तर का अनुभव हो सकता है, सीटीसी को एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स अटैचमेंट के बिना, एफएसएस के बहुत अधिक स्तर तक उजागर किया जाता है। शारीरिक रूप से, FSS परिमाण के 3-4 आदेश से अधिक पर्वतमाला, कम स्तर के साथ लिम्फाटिक्स में मौजूद (<1 dyne/सेमी2)और उच्चतम स्तर संक्षेप में मौजूद के रूप में कोशिकाओं को दिल के माध्यम से और दिल वाल्व के आसपास से गुजरती है (>५०० dynes/सेमी2)। विभिन्न समय सीमाओं पर शारीरिक कतरनी तनाव की विभिन्न श्रेणियों के मॉडल के लिए डिज़ाइन किए गए कुछ इन विट्रो मॉडल हैं। यह पेपर एक सरल सिरिंज और सुई प्रणाली का उपयोग करके कैंसर सेल जीव विज्ञान पर उच्च स्तरीय एफएसएस की संक्षिप्त (मिलीसेकंड) दालों के परिणामों की जांच करने के लिए एक मॉडल का वर्णन करता है।
Introduction
मेटास्टेसिस, या प्रारंभिक ट्यूमर साइट से परे कैंसर का प्रसार, कैंसर मृत्यु दर1अंतर्निहित एक प्रमुख कारक है। मेटास्टेसिस के दौरान, कैंसर कोशिकाएं पूरे शरीर में दूर के स्थलों तक प्रसारित करने के लिए एक राजमार्ग के रूप में संचार प्रणाली का उपयोग करती हैं2,3. इन साइटों के रास्ते में, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) उनके मूल प्राथमिकट्यूमर3,4,5के विपरीत एक गतिशील द्रव माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर मौजूद हैं। यह प्रस्ताव किया गया है कि यह तरल माइक्रोएनवायरमेंट मेटास्टेसिस4के कई अवरोधों में से एक है । मेटास्टैटिक अक्षमता की अवधारणा में व्यापक सहमति है, यानी कि अधिकांश सीटीसी परिसंचरण में प्रवेश करते हैं या तो नष्ट हो जाते हैं या उत्पादक मेटास्टैटिक उपनिवेश नहीं बनाते हैं6,7,8। हालांकि, क्यों मेटास्टेसिस एक व्यक्ति सीटीसी के नजरिए से अक्षम है कम निश्चित है और जांच का एक सक्रिय क्षेत्र बना हुआ है । सीटीसी को बाहृशियल मैट्रिक्स से अलग किया जाता है, जो घुलनशील विकास और जीवित रहने के कारकों से वंचित होते हैं जो प्राथमिक ट्यूमर में मौजूद हो सकते हैं, और प्राथमिक ट्यूमर4की तुलना में प्रतिरक्षा प्रणाली और हेमोडायनामिक बलों के संपर्क में हैं। इन कारकों में से प्रत्येक CTCs के गरीब अस्तित्व के लिए योगदान कर सकते हैं, लेकिन उनके सापेक्ष योगदान अस्पष्ट हैं । यह पत्र इस प्रश्न का समाधान करता है कि हीमोडायनामिक बल सीटीसी को कैसे प्रभावित करते हैं ।
सीटीसी पर हीमोडायनामिक बलों के प्रभावों का अध्ययन करना काफी चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान में, विट्रो सिस्टम में कोई इंजीनियर नहीं है जो पूरे स्थानिक तंत्र गतिशीलता (केशिकाओं के लिए दिल) और मानव संवहनी प्रणाली के रियोलॉजिकल गुणों को दोहरा सकता है। इसके अलावा, सीटीसी संचार प्रणाली का अनुभव कैसे करते हैं, यह पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है। प्रायोगिक साक्ष्य इंगित करता है कि अधिकांश कैंसर कोशिकाएं रक्त कोशिकाओं की तरह लगातार प्रसारित नहीं होती हैं। बल्कि, उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार (व्यास में 10-20 माइक्रोन) के कारण, अधिकांश सीटीसी समय की चर लंबाई (एस टू डेज) के लिए केशिका बिस्तरों (व्यास में 6-8 माइक्रोन) में फंस जाते हैं, जहां वे मर सकते हैं, अतिरिक्त हो सकते हैं, या अगलेकेशिका बिस्तर8, 9,10,11में विस्थापित हो सकते हैं। हालांकि, कुछ सबूत हैं कि सीटीसी का आकार वीवो में अधिक विषम हो सकता है, और छोटे सीटीसी12का पता लगाने योग्य हैं। इसलिए, दूरी और रक्त प्रवाह वेग के आधार पर, सीटीसी केवल फंसाने की इन अवधियों के बीच सेकंड के एक मामले के लिए स्वतंत्र रूप से प्रसारित कर सकते हैं, हालांकि इस व्यवहार का मात्रात्मक विवरण13की कमी है ।
इसके अलावा, जहां CTCs परिसंचरण में प्रवेश के आधार पर, वे फेफड़ों और अंय परिधीय साइटों में कई केशिका बिस्तरों के माध्यम से और दोनों सही और बाएं दिल के माध्यम से अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने से पहले पारित कर सकते हैं । रास्ते में, सीटीसी को तरल कतरनी तनाव (एफएसएस), माइक्रोसर्कुलेशन में फंसाने के दौरान संपीड़न बलों सहित विभिन्न हेमोडायनामिक तनावों से अवगत कराया जाता है, और संभावित रूप से, उन परिस्थितियों में कर्षण बल जहां वे रक्त वाहिका दीवारों के साथ ल्यूकोसाइट जैसे रोलिंग का प्रदर्शन कर सकते हैं14। इस प्रकार, दोनों परिसंचरण मॉडल और सीटीसी व्यवहार की समझ को मॉडल करने के लिए सीमित है । इस अनिश्चितता के कारण, इन विट्रो मॉडल सिस्टम से किसी भी निष्कर्ष को एक प्रयोगात्मक कशेरुकी जीव में और अंततः कैंसर रोगियों में मान्य किया जाना चाहिए ।
उपरोक्त चेतावनी के साथ, यह पेपर 201215में वर्णित सीटीसी पर एफएसएस के प्रभावों की जांच करने के लिए निलंबन में कोशिकाओं पर एफएसएस लागू करने के लिए अपेक्षाकृत सरल मॉडल प्रदर्शित करता है। एफएसएस के परिणामस्वरूप पोत की दीवार के खिलाफ रक्त प्रवाह के घर्षण से होता है, जो बड़े जहाजों में लैमिनार प्रवाह की स्थितियों के तहत पैराबोलिक वेग ढाल पैदा करता है। कोशिकाओं को पोत की दीवारों के पास एफएसएस के उच्च स्तर और रक्त वाहिका के केंद्र के पास निचले स्तर का अनुभव होता है। द्रव चिपचिपाहट, प्रवाह दर, और नाली के आयाम जिसके माध्यम से प्रवाह होता है FSS को प्रभावित करता है, जैसा कि हेगन-Poiseuille समीकरण द्वारा वर्णित है। यह न्यूटोनियन तरल पदार्थ के रूप में व्यवहार करने वाले रक्त प्रवाह पर लागू होता है, लेकिन माइक्रोसर्कुलेशन के लिए पकड़ नहीं करता है। शारीरिक एफएसएस परिमाण के कई आदेशों से अधिक होता है जिसमें लिम्फाटिक्स (<1 डाइन/सेमी2)में निम्नतम स्तर होते हैं और हृदय वाल्व और एथेरोस्क्लेरोटिक सजीले टुकड़े (>500 डायन/सेमी2) 5के आसपास के क्षेत्रों में उच्चतमहोताहै । धमनियों में मतलब दीवार कतरनी तनाव 10-70 dyn/cm2 और 1-6 dyn/सेमी2 नसों में16,17है ।
दिल में, कोशिकाओं को वाल्व पत्रक के आसपास अशांत प्रवाह के संपर्क में किया जा सकता है जहां बहुत उच्च स्तर, लेकिन बहुत कम अवधि के FSS18, 19अनुभव किया जा सकता है । हालांकि बायोप्रोसेसिंग फील्ड ने लंबे समय से निलंबन में स्तनधारी कोशिकाओं पर एफएसएस के प्रभावों का अध्ययन किया है, यह जानकारी सीटीसी पर एफएसएस के प्रभावों को समझने के लिए सीमित मूल्य की हो सकती है क्योंकि यह आम तौर पर लंबी अवधि20पर लागू एफएसएस के बहुत निचले स्तरों पर केंद्रित है। जैसा कि नीचे वर्णित है, एक सिरिंज और सुई का उपयोग करके, कोई भी कोशिका निलंबन के लिए अपेक्षाकृत कम (मिलीसेकंड) अवधि के लिए अपेक्षाकृत उच्च (दसियों से हजारों dyn/cm2)एफएसएस लागू कर सकता है। चूंकि इस मॉडल15के आरंभिक विवरण के बाद से अन्य लोगों ने कैंसर कोशिकाओं पर एफएसएस के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इसे21,22 , 23के रूपमेंनियोजितकिया है . एफएसएस की कई “दालें” डाउनस्ट्रीम प्रायोगिक विश्लेषणों को सुविधाजनक बनाने के लिए थोड़े समय में सेल निलंबन पर लागू की जा सकती हैं। उदाहरण के लिए, इस मॉडल का उपयोग लागू दालों की संख्या के एक समारोह के रूप में कोशिका व्यवहार्यता को मापने के द्वारा FSS द्वारा यांत्रिक विनाश का विरोध करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता को मापने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कैंसर कोशिकाओं के जीव विज्ञान पर FSS जोखिम के प्रभाव को विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करके खोजा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, सेल निलंबन का हिस्सा एक स्थिर नियंत्रण के रूप में आरक्षित है उन है कि सेल टुकड़ी और निलंबन में आयोजित समय के साथ जुड़ा हो सकता है से FSS के प्रभाव की तुलना ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कागज एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर निलंबन में कैंसर कोशिकाओं के लिए FSS के आवेदन को दर्शाता है । इस मॉडल का उपयोग करते हुए, कैंसर कोशिकाओं को उच्च स्तरीय एफएसएस की संक्षिप्त दालों के लिए अधिक प्रतिरोधी द?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां प्रदर्शित मॉडल के विकास को डीओडी ग्रांट W81XWH-12-1-0163, एनआईएच अनुदान R21 CA179981 और R21 CA196202, और सातो मेटास्टेसिस रिसर्च फंड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
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