Modellering virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller ved hjælp af en sprøjte og nål
Summary
Her demonstrerer vi en metode til at anvende væskeforskydningsstress på kræftceller i suspension for at modellere virkningerne af hæmodynamisk stress på cirkulerende tumorceller.
Abstract
Under metastaser får kræftceller fra fast væv, herunder epithelia, adgang til lymfe- og hæmatotogen cirkulation, hvor de udsættes for mekanisk stress på grund af hæmodynamisk flow. En af disse understreger, at cirkulerende tumorceller (CTCs) erfaring er væske forskydning stress (FSS). Mens kræftceller kan opleve lave niveauer af FSS i tumoren på grund af interstitiel flow, CTCs er udsat, uden ekstracellulære matrix vedhæftet fil, til langt større niveauer af FSS. Fysiologisk, FSS varierer over 3-4 størrelsesordener, med lave niveauer til stede i lymfeknuder (<1 dyne / cm2) og de højeste niveauer til stede kort som celler passerer gennem hjertet og omkring hjerteklapper (>500 dynes / cm2). Der er et par in vitro modeller designet til at modellere forskellige intervaller af fysiologiske forskydning stress over forskellige tidsrammer. Dette papir beskriver en model til at undersøge konsekvenserne af korte (millisekund) pulser af højt niveau FSS på kræft cellebiologi ved hjælp af en simpel sprøjte og nål system.
Introduction
Metastase, eller spredning af kræft ud over den oprindelige tumor site, er en vigtig faktor, der ligger til grund forkræftdødelighed 1. Under metastaser, kræftceller udnytte kredsløbssygdomme som en motorvej til at formidle til fjerne steder i hele kroppen2,3. Mens på vej til disse steder, cirkulerende tumorceller (CTCs) findes inden for en dynamisk flydende mikromiljø i modsætning til deres oprindelige primære tumor3,4,5. Det er blevet foreslået, at dette flydende mikromiljø er en af mange barrierer for metastaser4. Der er bred enighed om begrebet metastatisk ineffektivitet, dvs. Men hvorfor metastaser er ineffektive set ud fra en individuel CTC er mindre sikker og er fortsat et aktivt område for undersøgelsen. CTC’er er løsrevet fra ekstracellulær matrix, berøvet opløselige vækst- og overlevelsesfaktorer, der kan være til stede i den primære tumor, og udsættes for immunsystemet og hæmodynamiske kræfter på en meget anden måde end i den primære tumor4. Hver af disse faktorer kan bidrage til CTC’ernes dårlige overlevelse, men deres relative bidrag er uklare. Dette dokument behandler spørgsmålet om, hvordan hæmodynamiske kræfter påvirker CTCs.
At studere virkningerne af hæmodynamiske kræfter på CTC’er er ret udfordrende. I øjeblikket er der ingen manipuleret in vitro-systemer, der kan kopiere hele spatiotemporal dynamik (hjerte til kapillærer) og reologiske egenskaber af det menneskelige vaskulære system. Desuden er det ikke helt klart, hvordan CTC’er oplever kredsløbssystemet. Eksperimentelle beviser tyder på, at de fleste kræftceller ikke cirkulerer kontinuerligt som blodlegemer. På grund af deres relativt store størrelse (10-20 μm i diameter) bliver de fleste CTC’er i de fleste CTC’er i kapillar (6-8 μm i diameter) i varierende længder (s til dage), hvor de kan dø, ekstravasere eller fortrænges til den næste kapillær seng8,9,10,11. Der er dog noget, der tyder på, at CTC-størrelsen kan være mere heterogen in vivo, og at mindre CTC’er kan påvises12. Derfor, baseret på afstand og blodgennemstrømningshastighed, kan CTC’er kun cirkulere frit i et spørgsmål om sekunder mellem disse perioder med fastklemning, selvom en kvantitativ beskrivelse af denne adfærd mangler13.
Desuden, afhængigt af hvor CTC’er kommer ind i omløb, kan de passere gennem flere kapillære senge i lungerne og andre perifere steder og gennem både højre og venstre hjerte, før de når deres endelige destination. Undervejs udsættes CTC’er for forskellige hæmodynamiske belastninger, herunder væskeforskydningsstress (FSS), trykkræfter under deres fastklemning i mikrocirkulationen og potentielt trækkraftkræfter under omstændigheder, hvor de kan udvise leukocytlignende rulning langsblodkarvæggene 14. Således er både evnen til at modellere cirkulationen og forståelsen af CTC-adfærd, der skal modelleres, begrænset. På grund af denne usikkerhed bør eventuelle fund fra in vitro-modelsystemer valideres i en eksperimentel hvirveldyrorganisme og i sidste ende hos kræftpatienter.
Med de ovennævnte forbehold viser dette papir en relativt enkel model til at anvende FSS på celler i suspension for at undersøge virkningerne af FSS på CTC’er, der først blev beskrevet i 201215. FSS skyldes friktion af blodgennemstrømningen mod karvæggen, som producerer en parabolsk hastighed gradient under forhold med laminar flow i større fartøjer. Celler oplever højere niveauer af FSS nær karvægge og lavere niveauer nær midten af blodkarrene. Flydende viskositet, strømningshastighed og dimensioner af den kanal, gennem hvilken strømmen opstår, påvirker FSS, som beskrevet af Hagen-Poiseuille-ligningen. Dette gælder for blodstrømme, der opfører sig som newtonske væsker, men holder ikke for mikrocirkulationen. Fysiologisk FSS varierer over flere størrelsesordener med de laveste niveauer i lymfetiden (<1 dyn/cm2)og den højeste i områder omkring hjerteklapper og aterosklerotiske plaques (>500 dyn/cm2)5. Gennemsnitlig vægforskydningsbelastning i arterier er 10-70 dyn/cm2 og 1-6 dyn/cm2 i vener16,17.
I hjertet kan celler blive udsat for turbulente strømme omkring ventilfoldere, hvor meget højt niveau, men meget kort varighed FSS kan opleves18,19. Selv om biobehandlingsfeltet længe har undersøgt FSS’ virkninger på pattedyrceller i suspension, kan disse oplysninger være af begrænset værdi for forståelsen af FSS’ virkninger på CTC’er, da de generelt fokuserer på meget lavere niveauer af FSS anvendt over en lang varighed20. Som beskrevet nedenfor, ved hjælp af en sprøjte og nål, kan man anvende relativt høj (titusinder dyn / cm2) FSS for en relativt kort (millisekunder) varighed til en celle suspension. Siden den første beskrivelse af denne model15, andre har ansat den til at studere virkningerne af FSS på kræftceller21,22,23. Flere “pulser” af FSS kan anvendes på celleaffjedring på kort tid for at lette downstream eksperimentelle analyser. For eksempel kan denne model bruges til at måle cellernes evne til at modstå mekanisk ødelæggelse af FSS ved at måle celle levedygtighed som en funktion af antallet af anvendte impulser. Alternativt kan virkningerne af FSS eksponering på biologi kræftceller udforskes ved at indsamle celler til en række downstream-analyser. Det er vigtigt, at en del af celleophænget er reserveret som et statisk kontrolelement til sammenligning af virkningerne af FSS fra dem, der kan være forbundet med celleløsning og tid, der holdes i suspension.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir viser anvendelsen af FSS til kræftceller i suspension ved hjælp af en sprøjte og nål. Ved hjælp af denne model har kræftceller vist sig at være mere modstandsdygtige over for korte impulser af højt niveau FSS i forhold til ikke-transformerede epitelceller15,22,24. Desuden eksponering for FSS ved hjælp af denne model resulterer i en hurtig stigning i celle stivhed, aktivering af RhoA, og øget kortikale F-act…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Udviklingen af den model, der demonstreres her, blev støttet af DOD-tilskud W81XWH-12-1-0163, NIH-tilskud R21 CA179981 og R21 CA196202 og Sato Metastasis Research Fund.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
Referências
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
- Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
- Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. Pesquisa do Câncer. 10 (6), 357-359 (1950).
- Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2′-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Pesquisa do Câncer. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
- Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis–integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
- Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
- Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).
- Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
- Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
- Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
- Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Pesquisa do Câncer. 52 (6), 1399 (1992).
- Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
- Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
- O’Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
- Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
- Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
- Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
- Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
- Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
- Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
- Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
- Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
- Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).
