Modélisation des effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes à l’aide d’une seringue et d’une aiguille
Summary
Ici, nous démontrons une méthode pour appliquer la contrainte de cisaillement des fluides aux cellules cancéreuses en suspension pour modéliser les effets du stress hémodynamique sur les cellules tumorales circulantes.
Abstract
Au cours des métastases, les cellules cancéreuses des tissus solides, y compris les épithéliums, accèdent à la circulation lymphatique et hématogène où elles sont exposées à un stress mécanique dû au flux hémodynamique. L’un de ces stress que subissent les cellules tumorales circulantes (CCC) est le stress de cisaillement des fluides (FSS). Alors que les cellules cancéreuses peuvent présenter de faibles niveaux de FSS dans la tumeur en raison du flux interstitiel, les CTC sont exposés, sans attachement à la matrice extracellulaire, à des niveaux beaucoup plus élevés de FSS. Physiologiquement, le FSS varie sur 3-4 ordres de grandeur, avec de faibles niveaux présents dans les lymphatiques (<1 dyne/cm2) et les niveaux les plus élevés présents brièvement lorsque les cellules traversent le cœur et autour des valves cardiaques (>500 dynes/cm2). Il existe quelques modèles in vitro conçus pour modéliser différentes gammes de contraintes physiologiques de cisaillement sur différentes périodes. Cet article décrit un modèle pour étudier les conséquences de brèves impulsions (millisecondes) de FSS de haut niveau sur la biologie des cellules cancéreuses à l’aide d’un simple système de seringue et d’aiguille.
Introduction
Les métastases, ou la propagation du cancer au-delà du site tumoral initial, sont un facteur majeur sous-jacent à la mortalité par cancer1. Au cours des métastases, les cellules cancéreuses utilisent le système circulatoire comme une autoroute pour se dissémer vers des sites éloignés dans tout le corps2,3. En route vers ces sites, les cellules tumorales circulantes (CCC) existent au sein d’un microenvironnement fluide dynamique contrairement à celui de leur tumeur primaire d’origine3,4,5. Il a été proposé que ce microenvironnement fluide soit l’un des nombreux obstacles aux métastases4. Il existe un large consensus dans le concept d’inefficacité métastatique, c’est-à-dire que la plupart des CTCC entrant dans la circulation périssent ou ne forment pas de colonies métastatiques productives6,7,8. Cependant, la raison pour laquelle les métastases sont inefficaces du point de vue d’un CCT individuel est moins certaine et demeure un domaine d’investigation actif. Les CTCC sont détachés de la matrice extracellulaire, privés de facteurs solubles de croissance et de survie qui peuvent être présents dans la tumeur primaire, et exposés au système immunitaire et aux forces hémodynamiques d’une manière très différente de celle de la tumeur primaire4. Chacun de ces facteurs peut contribuer à la faible survie des CTCC, mais leurs contributions relatives ne sont pas claires. Cet article aborde la question de savoir comment les forces hémodynamiques affectent les CTCC.
L’étude des effets des forces hémodynamiques sur les CTCC est assez difficile. Actuellement, il n’existe aucun système in vitro conçu capable de reproduire l’ensemble de la dynamique spatio-temporelle (du cœur aux capillaires) et des propriétés rhéologiques du système vasculaire humain. De plus, la façon dont les CTCC vivent le système circulatoire n’est pas tout à fait claire. Les preuves expérimentales indiquent que la plupart des cellules cancéreuses ne circulent pas continuellement comme les cellules sanguines. Au contraire, en raison de leur taille relativement grande (10-20 μm de diamètre), la plupart des CCC sont piégés dans des lits capillaires (6-8 μm de diamètre) pendant des durées variables (s à jours) où ils peuvent mourir, extravaser ou être déplacés vers le lit capillaire suivant8,9,10,11. Cependant, il existe des preuves que la taille du CTC peut être plus hétérogène in vivo et que les CTC plus petits sont détectables12. Par conséquent, sur la base de la distance et de la vitesse du flux sanguin, les CTCC ne peuvent circuler librement que pendant quelques secondes entre ces périodes de piégeage, bien qu’il manque une description quantitative de ce comportement13.
De plus, selon l’endroit où les CCC pénètrent dans la circulation, ils peuvent traverser plusieurs lits capillaires dans le poumon et d’autres sites périphériques et à travers le cœur droit et gauche avant d’atteindre leur destination finale. En cours de route, les CTCC sont exposés à diverses contraintes hémodynamiques, y compris la contrainte de cisaillement des fluides (FSS), les forces de compression lors de leur piégeage dans la microcirculation et, potentiellement, les forces de traction dans des circonstances où ils pourraient présenter un roulement semblable à celui d’un leucocyte le long des parois des vaisseaux sanguins14. Ainsi, la capacité de modéliser la circulation et la compréhension du comportement CTC à modéliser sont limitées. En raison de cette incertitude, tout résultat de systèmes modèles in vitro doit être validé dans un organisme vertébré expérimental et, en fin de compte, chez des patients atteints de cancer.
Avec les mises en garde susmentionnées, cet article démontre un modèle relativement simple pour appliquer le FSS aux cellules en suspension afin de sonder les effets du FSS sur les CTC décrits pour la première fois en 201215. FSS résulte du frottement du flux sanguin contre la paroi des vaisseaux, ce qui produit un gradient de vitesse parabolique dans des conditions d’écoulement laminaire dans les plus gros vaisseaux. Les cellules éprouvent des niveaux plus élevés de FSS près des parois des vaisseaux et des niveaux plus bas près du centre du vaisseau sanguin. La viscosité du fluide, le débit et les dimensions du conduit à travers lequel l’écoulement se produit influencent FSS, comme décrit par l’équation de Hagen-Poiseuille. Cela s’applique aux flux sanguins se comportant comme des fluides newtoniens, mais ne tient pas pour la microcirculation. Le FSS physiologique varie sur plusieurs ordres de grandeur avec les niveaux les plus bas dans les lymphatiques (<1 dyn/cm 2 ) et les plus élevés dans les régionsautourdes valves cardiaques et des plaques d’athérosclérose (>500 dyn/cm2)5. Le stress moyen de cisaillement de la paroi dans les artères est de 10-70 dyn/cm2 et de 1-6 dyn/cm2 dans les veines16,17.
Dans le cœur, les cellules peuvent être exposées à des écoulements turbulents autour des folioles valvulaires où un niveau très élevé, mais de très courte durée FSS peut être expérimenté18,19. Bien que le domaine du biotraitement ait longtemps étudié les effets du FSS sur les cellules de mammifères en suspension, cette information peut être d’une valeur limitée pour comprendre les effets du FSS sur les CTCC car elle se concentre généralement sur des niveaux beaucoup plus faibles de FSS appliqués sur une longue durée20. Comme décrit ci-dessous, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, on peut appliquer un FSS relativement élevé (des dizaines à des milliers dedyn/cm2)pendant une durée relativement courte (millisecondes) sur une suspension cellulaire. Depuis la description initiale de ce modèle15,d’autres l’ont utilisé pour étudier les effets du FSS sur les cellules cancéreuses21,22,23. De multiples « impulsions » de FSS peuvent être appliquées à des suspensions cellulaires en peu de temps pour faciliter les analyses expérimentales en aval. Par exemple, ce modèle peut être utilisé pour mesurer la capacité des cellules à résister à la destruction mécanique par FSS en mesurant la viabilité des cellules en fonction du nombre d’impulsions appliquées. Alternativement, les effets de l’exposition au FSS sur la biologie des cellules cancéreuses peuvent être explorés en collectant des cellules pour une variété d’analyses en aval. Il est important de savoir qu’une partie de la suspension cellulaire est réservée en tant que contrôle statique pour comparer les effets du FSS de ceux qui pourraient être associés au détachement cellulaire et au temps passé en suspension.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article démontre l’application du FSS aux cellules cancéreuses en suspension à l’aide d’une seringue et d’une aiguille. En utilisant ce modèle, il a été démontré que les cellules cancéreuses sont plus résistantes aux brèves impulsions de FSS de haut niveau par rapport aux cellules épithéliales non transformées15,22,24. De plus, l’exposition au FSS à l’aide de ce modèle entraîne une augmentation r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le développement du modèle démontré ici a été soutenu par la subvention W81XWH-12-1-0163 du DOD, les subventions R21 CA179981 et R21 CA196202 des NIH et le Sato Metastasis Research Fund.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
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