Modelado de los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes utilizando una jeringa y una aguja
Summary
Aquí demostramos un método para aplicar estrés por cizallamiento de fluidos a las células cancerosas en suspensión para modelar los efectos del estrés hemodinámico en las células tumorales circulantes.
Abstract
Durante la metástasis, las células cancerosas de tejidos sólidos, incluidos los epitelios, obtienen acceso a la circulación linfática y hematógena donde están expuestas al estrés mecánico debido al flujo hemodinámico. Una de estas tensiones que experimentan las células tumorales circulantes (CTC) es el estrés por cizallamiento de fluidos (FSS). Si bien las células cancerosas pueden experimentar niveles bajos de FSS dentro del tumor debido al flujo intersticial, las CTC están expuestas, sin unión a la matriz extracelular, a niveles mucho mayores de FSS. Fisiológicamente, el FSS oscila entre 3 y 4 órdenes de magnitud, con niveles bajos presentes en los linfáticos (500 dinas/cm2). Hay algunos modelos in vitro diseñados para modelar diferentes rangos de tensión de cizallado fisiológico en varios marcos de tiempo. Este artículo describe un modelo para investigar las consecuencias de pulsos breves (milisegundos) de FSS de alto nivel en la biología de las células cancerosas utilizando un sistema simple de jeringas y agujas.
Introduction
La metástasis, o la diseminación del cáncer más allá del sitio inicial del tumor, es un factor importante que subyace a la mortalidad por cáncer1. Durante la metástasis, las células cancerosas utilizan el sistema circulatorio como una autopista para diseminarse a sitios distantes en todo el cuerpo2,3. Mientras se dirige a estos sitios, las células tumorales circulantes (CTC) existen dentro de un microambiente fluido dinámico a diferencia del de su tumor primario original3,4,5. Se ha propuesto que este microambiente fluido es una de las muchas barreras para la metástasis4. Existe un amplio acuerdo en el concepto de ineficiencia metastásica, es decir, que la mayoría de los CTC que entran en circulación perecen o no forman colonias metastásicas productivas6,7,8. Sin embargo, por qué la metástasis es ineficiente desde la perspectiva de un CTC individual es menos seguro y sigue siendo un área activa de investigación. Las CTC están separadas de la matriz extracelular, privadas de factores solubles de crecimiento y supervivencia que pueden estar presentes en el tumor primario, y expuestas al sistema inmune y a las fuerzas hemodinámicas de una manera muy diferente a la del tumor primario4. Cada uno de estos factores puede contribuir a la escasa supervivencia de los CTC, pero sus contribuciones relativas no están claras. Este artículo aborda la cuestión de cómo las fuerzas hemodinámicas afectan a las CTC.
Estudiar los efectos de las fuerzas hemodinámicas en los CTC es bastante desafiante. Actualmente, no existen sistemas in vitro diseñados que puedan replicar toda la dinámica espaciotemporal (corazón a capilares) y las propiedades reológicas del sistema vascular humano. Además, la forma en que los CTC experimentan el sistema circulatorio no está del todo clara. La evidencia experimental indica que la mayoría de las células cancerosas no circulan continuamente como las células sanguíneas. Más bien, debido a su tamaño relativamente grande (10-20 μm de diámetro), la mayoría de los CTC quedan atrapados en lechos capilares (6-8 μm de diámetro) durante períodos variables de tiempo (s a días) donde pueden morir, extravasar o ser desplazados al siguiente lecho capilar8,9,10,11. Sin embargo, hay algunas pruebas de que el tamaño de la CTC puede ser más heterogéneo in vivo, y que las CTC más pequeñas son detectables12. Por lo tanto, en función de la distancia y la velocidad del flujo sanguíneo, los CTC solo pueden circular libremente durante cuestión de segundos entre estos períodos de atrapamiento, aunque falta una descripción cuantitativa de este comportamiento13.
Además, dependiendo de dónde entren en circulación los CTC, pueden pasar a través de múltiples lechos capilares en el pulmón y otros sitios periféricos y a través del corazón derecho e izquierdo antes de llegar a su destino final. En el camino, los CTC están expuestos a diversas tensiones hemodinámicas, incluida la tensión de cizallamiento de fluidos (FSS), las fuerzas de compresión durante su atrapamiento en la microcirculación y, potencialmente, las fuerzas de tracción en circunstancias en las que podrían exhibir un rodar similar a un leucocitos a lo largo de las paredes de los vasos sanguíneos14. Por lo tanto, tanto la capacidad de modelar la circulación como la comprensión del comportamiento de CTC a modelar es limitada. Debido a esta incertidumbre, cualquier hallazgo de los sistemas modelo in vitro debe validarse en un organismo vertebrado experimental y, en última instancia, en pacientes con cáncer.
Con las advertencias antes mencionadas, este trabajo demuestra un modelo relativamente simple para aplicar FSS a células en suspensión para sondear los efectos de FSS en CTC descritos por primera vez en 201215. FSS resulta de la fricción del flujo sanguíneo contra la pared del vaso, lo que produce un gradiente de velocidad parabólica en condiciones de flujo laminar en vasos más grandes. Las células experimentan niveles más altos de FSS cerca de las paredes de los vasos y niveles más bajos cerca del centro del vaso sanguíneo. La viscosidad del fluido, el caudal y las dimensiones del conducto a través del cual se produce el flujo influyen en el FSS, como se describe en la ecuación de Hagen-Poiseuille. Esto se aplica a los flujos sanguíneos que se comportan como fluidos newtonianos, pero no se mantienen para la microcirculación. El FSS fisiológico varía en varios órdenes de magnitud con los niveles más bajos en los linfáticos (<1 dyn/cm2) y los más altos en las regiones alrededor de las válvulas cardíacas y las placas ateroscleróticas (>500 dyn/cm2)5. El esfuerzo cizallamiento medio de la pared en las arterias es de 10-70 dinas/cm2 y de 1-6 dinares/cm2 en las venas16,17.
En el corazón, las células pueden estar expuestas a flujos turbulentos alrededor de las valvas de las válvulas donde se puede experimentar FSS de muy alto nivel, pero de muy corta duración18,19. Aunque el campo del bioprocesamiento ha estudiado durante mucho tiempo los efectos de FSS en células de mamíferos en suspensión, esta información puede ser de valor limitado para comprender los efectos de FSS en CTC, ya que generalmente se centra en niveles mucho más bajos de FSS aplicados durante una larga duración20. Como se describe a continuación, usando una jeringa y una aguja, se puede aplicar FSS relativamente alto (decenas a miles de dinas / cm2)durante una duración relativamente corta (milisegundos) a una suspensión celular. Desde la descripción inicial de este modelo15,otros lo han empleado para estudiar los efectos del FSS sobre las células cancerosas21,22,23. Se pueden aplicar múltiples “pulsos” de FSS a las suspensiones celulares en un corto período de tiempo para facilitar los análisis experimentales posteriores. Por ejemplo, este modelo se puede utilizar para medir la capacidad de las células para resistir la destrucción mecánica por FSS midiendo la viabilidad celular en función del número de pulsos aplicados. Alternativamente, los efectos de la exposición a FSS en la biología de las células cancerosas se pueden explorar mediante la recolección de células para una variedad de análisis posteriores. Es importante destacar que parte de la suspensión celular se reserva como un control estático para comparar los efectos de FSS de aquellos que podrían estar asociados con el desprendimiento celular y el tiempo mantenido en suspensión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo demuestra la aplicación de FSS a las células cancerosas en suspensión utilizando una jeringa y una aguja. Usando este modelo, se ha demostrado que las células cancerosas son más resistentes a pulsos breves de FSS de alto nivel en relación con las células epiteliales no transformadas15,22,24. Además, la exposición a FSS utilizando este modelo resulta en un rápido aumento de la rigidez celular, la activaci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo del modelo demostrado aquí fue apoyado por la subvención del DOD W81XWH-12-1-0163, las subvenciones de los NIH R21 CA179981 y R21 CA196202, y el Fondo de Investigación de Metástasis Sato.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
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