हम दंत पट्टिका को छानकर और मेजबान बैक्टीरिया के साथ सह-संस्कृति को फ़िल्टर करके उपन्यास बैक्टीरियल फिलम, सैकरिब्टीरिया के कठिन-से-बढ़ने वाले सदस्यों को अलग-थलग करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।
कई जीवाणु प्रजातियों मानक तरीकों का उपयोग कर प्रयोगशाला में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, पृथ्वी पर माइक्रोबियल विविधता के बहुमत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा प्रस्तुत । उपन्यास दृष्टिकोण इन असंस्कारी बैक्टीरिया संस्कृति के लिए आवश्यक है ताकि जांचकर्ताओं प्रभावी ढंग से प्रयोगशाला में उपलब्ध शक्तिशाली उपकरणों का उपयोग कर अपने शरीर विज्ञान और जीवन शैली का अध्ययन कर सकते हैं । उम्मीदवार फिला विकिरण (सीपीआर) अकृषित बैक्टीरिया के सबसे बड़े समूहों में से एक है, जिसमें पृथ्वी पर रहने वाली विविधता का ~ 15% शामिल है। इस ग्रुप का पहला आइसोल्यूज सैकरबैक्टीरिया फिलम,नैनोसिनबैक्टर टाइटस स्ट्रेनटीएम7एक्स का सदस्य था। TM7x एक असामान्य रूप से छोटा जीवाणु है जो एक बैक्टीरियल होस्ट, Schaalia odontolytica, तनाव XH001 के सीधे संपर्क में एक सहजीवी के रूप में रहता है। असामान्य रूप से छोटे सेल आकार और एक सहजीवी जीव के रूप में इसकी जीवन शैली का लाभ उठाते हुए, हमने दंत पट्टिका से तेजी से संस्कृति सैकरिबाक्टेरिया के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। यह प्रोटोकॉल दिखाएगा कि 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से दंत पट्टिका के निलंबन को कैसे फ़िल्टर किया जाए, फिर एकत्र सैकरिबाक्टेरिया कोशिकाओं को केंद्रित करें और मेजबान जीवों की संस्कृति को संक्रमित करें। परिणामस्वरूप कूकल्चर को किसी भी सामान्य जीवाणु संस्कृति के रूप में पारित किया जा सकता है और पीसीआर द्वारा संक्रमण की पुष्टि की जाती है। परिणामस्वरूप बाइनरी संस्कृति प्रयोगशाला में बनाए रखा जा सकता है और भविष्य के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया। जबकि संदूषण एक संभावना है, बाइनरी संस्कृति को या तो आगे फ़िल्टर करने और मेजबान के पुनर्निर्ण द्वारा, या संक्रमित उपनिवेशों के लिए बाइनरी संस्कृति और स्क्रीनिंग चढ़ाना द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य नमूना प्रकारों और वातावरण में विस्तारित किया जा सकता है, जिससे सीपीआर में कई और प्रजातियों की खेती होती है।
बैक्टीरिया की उपन्यास प्रजातियों को तैयार करना और उन्हें प्रयोगशाला में लाना शक्तिशाली प्रयोगों के लिए उनके माइक्रोबियल समुदाय के भीतर उनके शरीर विज्ञान और व्यापक बातचीत को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है। हालांकि इन प्रश्नों (जैसे, “मेटा-ओमिक्स”) से पूछताछ करने के संस्कृति-मुक्त तरीके हैं, विविध माइक्रोबियल आबादी की जटिल बातचीत से एकल चर को अलग करना और सार्थक निष्कर्ष तक पहुंचना मुश्किल हो जाता है। जबकि बैक्टीरिया की खेती के कई फायदे हैं, एक जीवाणु को अलग करने और इसे शुद्ध संस्कृति में उगाने के लिए कई संभावित बाधाएं हैं । संभावित विशिष्ट विकास आवश्यकताओं में पीएच, ऑक्सीजन तनाव, विटामिन, विकास कारक, संकेत अणुओं या यहां तक कि प्रत्यक्ष कोशिका संपर्क को विकास1प्रकाश में लाना शामिल है । हालांकि, यह माना जाता है कि विशिष्ट auxotrophies बैक्टीरिया की नई प्रजातियों को बनाने के लिए प्राथमिक निवारक हैं । मानक मीडिया योगों में विशिष्ट विटामिन या कार्बन स्रोतों जैसे अकृषित बैक्टीरिया द्वारा आवश्यक कई पोषक तत्वों की कमी होती है। ये लापता अणु असंस्कारी बैक्टीरिया के शरीर विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं और आमतौर पर माइक्रोबियल समुदाय या मेजबान जीव में किसी अन्य जीव द्वारा प्रदान किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, म्यूसिन जैसे जटिल कार्बोहाइड्रेट पशु मेजबानों द्वारा प्रदान किए जा सकते हैं। इन्हें मीडिया में जोड़ने से जानवरों की हिम्मत से कई बैक्टीरिया की खेती की अनुमति मिली है, जिनमें अक्करमैंसिया म्यूसिनीफिला और मुसिनिवरान्स हिरुडिनिस2,3,4शामिल हैं । कई रोगजनक बैक्टीरिया ने पशु कोशिकाओं में हेमिन से बंधे लोहे का उपयोग करने की क्षमता विकसित की है, जिसमें मौखिक रोगजनक पोर्फाइट्रोमोनास जिंगिवलिस5शामिल हैं। प्रयोगशाला में, पोर्फाइट्रोमोनास और अन्य जीवों के विकास को हेमिन6के अलावा उत्तेजित किया जा सकता है।
हाल ही में, बैक्टीरिया के उपन्यास आइसोलेट को बनाने में कई सफलताएं सह-संस्कृति के माध्यम से आई हैं, जो उनके विकास के लिए आवश्यक असंस्कारी बैक्टीरिया को विशिष्ट कारक प्रदान करने के लिए “फीडर” जीव का उपयोग कर रही हैं। वर्तौकियन और उनके सहयोगियों के एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन से पता चला है कि बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित लोहे के बंधन वाले अणुओं ने कई उपन्यास मौखिक आइसोलेशन के विकास को प्रेरित किया। छद्ममोनाडप्रजातियों द्वारा उत्पादित एक प्रकार के साइडरोफोर, पाइवरेडिन्स को एक उपन्यास प्रीवोटेला प्रजाति7के विकास को काफी सुविधाजनक बनाने के लिए दिखाया गया था। इसी अध्ययन में, फिलम क्लोरोफ्लेक्सी के लिए पहली मौखिक आइसोलेट की खेती की गई थी, साथ ही एफ न्यूलेटम का उपयोग एक सहायक के रूप में कुछ अभी तक अज्ञात यौगिक7प्रदान करने के लिए किया गया था। हाल ही में, रुमिनोकोसीसी जीनस से एक जीवाणु को सहायक जीव8के रूप में बैक्टीरियोइड कमजोरता का उपयोग करके अलग किया गया था। बाद में यह दिखाया गया कि प्रयोगशाला मीडिया पर विकास के लिए एक निरोधात्मक न्यूरोट्रांसमीटर गामा अमीनोबुटिरिक एसिड (गाबा) की आवश्यकता थी। फीडर जीवों का उपयोग करना विशिष्ट माइक्रोएनवायरमेंट्स की नकल करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति साबित हुआ है जहां असंस्कारी बैक्टीरिया बढ़ते हैं, जो विभिन्न सांद्रता में विभिन्न योजकों के साथ विकास मीडिया को लगातार सुधारने की तुलना में अधिक कुशल हैं।
असंस्कारी बैक्टीरिया के सबसे बड़े समूहों में से एक “उम्मीदवार फायला विकिरण” (सीपीआर) में हैं, जो कई उम्मीदवार बैक्टीरियल फिला9,10का मोनोफिलेटिक समूह है। इस लेखन के रूप में, सीपीआर के भीतर केवल Saccharibacteria phylum के सदस्यों को सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में सुसंस्कृत किया गया है । पहला आइसोलेटेड,‘नैनोसिनबैक्टर lyticus’ तनाव TM7x, एंटीबायोटिक स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग करके अलग किया गया था, जिसे असंस्कारी TM711, 12के लिए समृद्ध करने की भविष्यवाणी की गई थी। इस काम की एक महत्वपूर्ण खोज यह थी कि नया आइसोले एक बैक्टीरियल होस्ट, स्चालिया ओडोन्टोलिटिकाके साथ सीधे संपर्क में बढ़ते परजीवी के रूप में बढ़ा, और माइक्रोस्कोपी से पता चला कि ये परजीवी अल्ट्रास्मॉल बैक्टीरिया थे।
इन सुरागों का उपयोग करके, हमने 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से दंत पट्टिका और अन्य मौखिक नमूनों को फ़िल्टर करके अपने भागीदारों के साथ सैकरिबेक्टेरिया के बाइनरी कोकल्चर को जल्दी से स्थापित करने के लिए एक विधि तैयार की, अपकेंद्री द्वारा फिलेट में कोशिकाओं को इकट्ठा किया और उम्मीदवार मेजबान बैक्टीरिया की संस्कृतियों को संक्रमित करने के लिए उनका उपयोग किया। इस विधि से संवर्धन संस्कृतियों से बचने का लाभ है, जो तेजी से बढ़ते जीवों से अभिभूत हो सकता है। यह एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग से भी बचता है, जो या तो लक्षित सैकरबैक्टीरिया प्रजातियों या उनके मेजबानों के विकास को रोक सकता है । यहां प्रदर्शित विधि का उपयोग करते हुए, हमने सैकरिबाक्टेरिया फिलम से 32 आइसोलेटेड को सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया है।
पट्टिका को छानने और मेजबान जीवों की शुद्ध संस्कृतियों पर इसे लागू करने की हमारी विधि काफी हद तक पहले संस्कारी सैकरिबाक्टेरिया,‘नैनोसिनबैक्टर लितस’ तनाव टीएम 7एक्स11,14,15पर पहले की टिप्पणियों पर आधारित है। छोटे सेल आकार को देखते हुए, हमने यह डगमगाया कि उन्हें फिल्टर का उपयोग करके दंत पट्टिका से अलग किया जा सकता है और अपकेंद्री के साथ केंद्रित किया जा सकता है। दूसरा, चूंकि ये जीव परजीवी के रूप में रहते हैं, इन कोशिकाओं को मेजबानों की शुद्ध संस्कृतियों को प्रदान करने से उन्हें सिम्बायोसिस में प्रवेश करने और बाइनरी संस्कृतियों के रूप में बढ़ने की अनुमति मिलेगी।
इस विधि का एक लाभ यह है कि इसके लिए संवर्धन संस्कृति या चयनात्मक दबाव की आवश्यकता नहीं है। ‘नैनोसिनबैक्टर लिटिकस ‘ तनाव TM7x एक चयनात्मक एजेंट के रूप में स्ट्रेप्टोमाइसिन का उपयोग कर एक संवर्धन संस्कृति से सुसंस्कृत किया गया था, जो अनुक्रमण का सुझाव दिया था Saccharibacteria के लिए समृद्ध करने में प्रभावी होगा । आकस्मिक रूप से,‘नैनोसिनबैक्टर लॉटिकस’ स्कालिया ओडोन्टोलिटिकाके लिए मेजबान, स्ट्रेप्टोमाइसिन16के लिए प्रतिरोधी होने के लिए जाना जाता है। एक चयनात्मक एजेंट के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग भी मेजबान जीव को बढ़ने से रोक सकता है, जो बदले में सैकरिबाक्टेरिया के विकास को बाधित करेगा।
संवर्धन संस्कृतियों का उपयोग करने का एक बड़ा मुद्दा यह है कि तेजी से बढ़ते जीव जल्दी से ब्याज के जीवों को विस्थापित कर देंगे । मौखिक गुहा में, उदाहरण के लिए, स्ट्रेप्टोकोकस प्रजातियां तेजी से बढ़ सकती हैं और, यदि चीनी विकास माध्यम में मौजूद है, तो मध्यम को अम्लीय करने के लिए पर्याप्त एसिड का उत्पादन करें, और ब्याज के जीवों के खिलाफ चयन करें। एक संवर्धन संस्कृति और चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं से बचने के द्वारा, हमारी विधि एक सामान्य दृष्टिकोण प्रदान करती है जिसे इन अन्य तरीकों की जटिलताओं के बिना सैकरिबाक्टेरिया और संभावित मेजबानों की एक व्यापक श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत विधि में कुछ बाधाएं हैं। सबसे पहले, यह विधि मानती है कि सैकरबैक्टीरिया बाइनरी संस्कृति में रहते हैं। हमने उनकी प्रभावशीलता को मापने के लिए ट्रिनारी या टर्नरी संस्कृतियों के संयोजनों का परीक्षण नहीं किया है, लेकिन संभावना है कि विकास कारकों की आवश्यकता होती है कि एक मेजबान जीव आपूर्ति नहीं कर सकता है। मौखिक बैक्टीरिया के विशाल संयोजनों का परीक्षण करना जो सैकरिबाक्टेरिया के विकास का समर्थन कर सकता है, एक चुनौतीपूर्ण काम होगा। दूसरा, विधि मानता है कि सभी सैकरिबाक्टेरिया 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरने के लिए काफी छोटे हैं। यह हो सकता है कि अन्य Saccharibacteria विश्वास से बड़े हैं और फिल्टर इन जीवों के खिलाफ चयन कर रहा है। एक बड़ा ताकना आकार के साथ एक फिल्टर का इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह संक्रमित सह संस्कृति में अधिक अवांछित मौखिक बैक्टीरिया की अनुमति का खतरा चलाता है । अंत में, यह बहुत मुश्किल है कि पहले से ही प्रकाशित किया गया है के बाहर मेजबान प्रजातियों को खोजने के लिए । इस प्रकार अब तक, एकमात्र सफल मेजबान जेनेरा ऐक्टिनोमाइस, स्कालिया, अराचनिया और सेल्यूलोसिमिक्रोबियम,फिलम एक्टिनोबैक्टीरिया15, 17,18के सभी सदस्यों की प्रजातियां हैं। हालांकि, ये मेजबान केवल विशिष्ट सैकरबैक्टीरिया के विकास का समर्थन करते हैं। सैकरबैक्टीरिया की अधिक प्रजातियों को संस्कृति देने के लिए, कई और मेजबानों का पता लगाया जाना चाहिए।
हमें उम्मीद है कि यहां प्रस्तुत विधि सैचरिब्टीरिया और अन्य सीपीआर जीवों के भविष्य के अनुसंधान में सहायता करेगी । मेटाजन्नोमिक अनुक्रमण से पता चलता है कि इन जीवों में छोटे जीनोम भी होते हैं और इन जीवों को सहजीवी होने की आशंका होती है या स्थानीय माइक्रोबियल समुदाय पर भरोसा करते हैं ताकि मेटाबोलाइट्स और उनकेअस्तित्वके लिए महत्वपूर्ण अन्य कारकों की आपूर्ति की जा सके । इन जीवों को अलग करने के लिए एक समान फ़िल्टरिंग रणनीति का उपयोग किया जा सकता है, बशर्ते कि वे काफी छोटे हों और उनके मेजबान जीवों (एस) को सुसंस्कृत किया जा सके। यहां वर्णित तरीकों बैक्टीरिया के इस बड़े और विविध समूह के लिए प्रयोगशाला संस्कृति के शक्तिशाली उपकरण लाने के लिए एक पहला कदम हैं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को सहायक चर्चा के लिए और जीवाणु उपभेदों प्रदान करने के लिए ऐनी टानर, ब्रूस पास्टर, Heike Boisvert, Xuesong वह और Batbileg बोर शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम माइक्रोबियल तकनीकी सहायता के लिए सुसान योस्ट और जेसिका वुड्स को धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च द्वारा पुरस्कार संख्या R37 DE016937 (फेड), R01 DE024468 (FED) और T32 DE007327 (एजेसी) के तहत समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |