Vi demonstrerar en metod för att isolera svårodlande medlemmar av den nya bakteriella fylumen, Saccharibacteria, genom att filtrera tandplack och samkultur med värdbakterier.
Många bakteriearter kan inte odlas i laboratoriet med hjälp av standardmetoder, vilket utgör ett betydande hinder för att studera majoriteten av mikrobiell mångfald på jorden. Nya metoder krävs för att odla dessa okulverterade bakterier så att utredarna effektivt kan studera sin fysiologi och livsstil med hjälp av de kraftfulla verktyg som finns tillgängliga i laboratoriet. Kandidaten Phyla Radiation (HLR) är en av de största grupperna av obrukade bakterier, som omfattar ~15% av den levande mångfalden på jorden. Det första isolatet av denna grupp var en medlem av Saccharibacteria phylum, ‘Nanosynbacter lyticus‘ stam TM7x. TM7x är en ovanligt liten bakterie som lever som symbiont i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, stam XH001. Genom att dra nytta av den ovanligt lilla cellstorleken och dess livsstil som en symbiotisk organism utvecklade vi ett protokoll för att snabbt odla Saccharibacteria från tandplack. Detta protokoll kommer att visa hur man filtrerar en suspension av tandplack genom ett 0,2 μm filter, koncentrera sedan de insamlade Saccharibacteria-cellerna och infektera en kultur av värdorganismer. Den resulterande kokulturen kan passeras som alla normala bakteriekultur och infektion bekräftas av PCR. Den resulterande binära kulturen kan upprätthållas i laboratoriet och användas för framtida experiment. Medan förorening är en möjlighet, kan den binära kulturen renas genom antingen ytterligare filtrering och återinfektion av värd, eller genom plätering av binär kultur och screening för infekterade kolonier. Vi hoppas att detta protokoll kan utvidgas till andra provtyper och miljöer, vilket leder till odling av många fler arter i HLR.
Genom att odla nya bakteriearter och föra in dem i laboratoriet kan kraftfulla experiment bättre förstå deras fysiologi och bredare interaktioner inom deras mikrobiella samhälle. Även om det finns kulturfria metoder för att förhöra dessa frågor (t.ex. “meta-omics”), gör de komplexa interaktionerna hos olika mikrobiella populationer det svårt att reta isär enskilda variabler och nå meningsfulla slutsatser. Medan odling av bakterier har många fördelar, finns det många potentiella hinder för att isolera en bakterie och odla den i ren kultur. Potentiella specifika tillväxtbehov inkluderar pH, syrespänning, vitaminer, tillväxtfaktorer, signalmolekyler eller till och med direkt cellkontakt för att framkalla tillväxt1. Man tror dock att specifika auxotroféer är det främsta avskräckande för odling av nya arter av bakterier. Standarda medieformuleringar saknar många näringsämnen som krävs av obrukade bakterier, såsom specifika vitaminer eller kolkällor. Dessa saknade molekyler kan vara nyckeln till de okulverterade bakteriernas fysiologi och tillhandahålls vanligtvis av antingen en annan organism i det mikrobiella samhället eller en värdorganism. Till exempel kan komplexa kolhydrater som muciner tillhandahållas av djurvärdar. Att lägga till dessa till media har gjort det möjligt att odla flera bakterier från djurinälvor, inklusive Akkermansia muciniphila och Mucinivorans hirudinis2,3,4. Många patogena bakterier har utvecklat förmågan att använda järn som är bundet till hemin i djurceller, inklusive den orala patogenen Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan tillväxten av Porphyromonas och andra organismer stimuleras genom tillsats av hemin6.
På senare tid har många genombrott i odling av nya isolat av bakterier kommit genom samodling, med hjälp av en “feeder” organism för att ge specifika faktorer till okulturerade bakterier som är nödvändiga för deras tillväxt. En elegant studie av Vartoukian och kollegor visade att siderophores, järnbindande molekyler producerade av bakterier, stimulerade tillväxten av flera nya orala isolat. Pyoverdines, en typ av siderophore produceras av pseudomonadarter, visade sig avsevärt underlätta tillväxten av en ny Prevotella art7. I samma studie odlades det första orala isolatet för fylumkloroflexi, även med F. nucleatum som hjälpare för att tillhandahålla några ännu okända förening7. Mer nyligen isolerades en bakterie från släktet Ruminococcaceae med Bacteroides fragilis som hjälparorganism8. det visades senare att gamma aminosmörsyra (GABA), en hämmande signalsubstans, krävdes för tillväxt på laboratoriemedier. Att använda matarorganismer har visat sig vara en viktig strategi för att efterlikna specifika mikromiljöer där obrukade bakterier växer, och är effektivare än att kontinuerligt omformulera tillväxtmedier med olika tillsatser i olika koncentrationer.
En av de största grupperna av okulturerade bakterier finns i “Candidate Phyla Radiation” (HLR), en monofyletisk grupp av flera kandidatbakterier phyla9,10. Från och med detta skrivande har endast medlemmar av Saccharibacteria fylum inom HLR framgångsrikt odlats i laboratoriet. Det första isolatet,” Nanosynbacter lyticus stam TM7x, isolerades med hjälp av antibiotikumet streptomycin, som hade förutspåtts berika för den obrukade TM711,12. En viktig upptäckt av detta arbete var att det nya isolatet växte som en parasit som växer i direkt kontakt med en bakteriell värd, Schaalia odontolytica, och mikroskopi visade att dessa parasiter var ultrasmå bakterier.
Med hjälp av dessa ledtrådar utformade vi en metod för att snabbt etablera binära kokulturer av Saccharibacteria med sina partners genom att filtrera tandplack och andra orala prover genom ett 0,2 μm-filter, samla celler i filtratet genom centrifugation och använda dem för att infektera kulturer av kandidatvärdbakterier. Denna metod har fördelen att undvika anrikningskulturer, som kan överväldigas av snabbväxande organismer. Det undviker också användningen av antibiotika, vilket kan stoppa tillväxten av antingen den riktade Saccharibacteria-arten eller deras värdar. Med hjälp av metoden som demonstreras här har vi framgångsrikt odlat 32 isolat från Saccharibacteria fylum.
Vår metod att filtrera plack och applicera den på rena kulturer av värdorganismer är till stor del baserad på tidigare observationer på den första odlade Saccharibacteria, “Nanosynbacter lyticus stam TM7x11,14,15. Med tanke på den lilla cellstorleken drog vi slutsatsen att de kunde separeras från tandplack med hjälp av ett filter och koncentreras med centrifugation. För det andra, eftersom dessa organismer lever som parasiter, skulle förutsatt att dessa celler rena kulturer av värdar skulle göra det möjligt för dem att gå in i en symbios och växa som binära kulturer.
En fördel med denna metod är att den inte kräver en anrikningskultur eller selektivt tryck. Nanosynbacter lyticus stam TM7x odlades från en anrikningskultur med streptomycin som selektivt medel, vilket sekvensering hade föreslagit skulle vara effektivt för berikning för Saccharibacteria. Slumpartat är värden för ‘Nanosynbacter lyticus ‘ Schaalia odontolytica, känd för att vara resistent mot streptomycin16. Att använda antibiotika som selektivt medel skulle också kunna hindra värdorganismen från att växa, vilket i sin tur skulle förhindra tillväxten av Saccharibacteria.
En större fråga om att använda anrikningskulturer är att snabbväxande organismer snabbt kommer att tränga undan organismer av intresse. I munhålan kan till exempel Streptococcus-arter växa snabbt och, om socker finns i tillväxtmediet, producera tillräckligt med syra för att försura mediet, ytterligare välja mot organismer av intresse. Genom att undvika en anrikningskultur och selektiv antibiotika ger vår metod en allmän strategi som kan tillämpas på ett bredare spektrum av Saccharibacteria och potentiella värdar utan komplikationer av dessa andra metoder.
Det finns vissa hinder för den metod som presenteras här. För det första förutsätter denna metod att Saccharibacteria lever i en binär kultur. Vi har inte testat kombinationer av trinary eller ternary kulturer för att mäta deras effektivitet, men det finns sannolikt Saccharibacteria som kräver tillväxtfaktorer som en enda värdorganism inte kan leverera. Att testa de stora kombinationerna av orala bakterier som kan stödja tillväxten av Saccharibacteria skulle vara en skrämmande uppgift. För det andra antar metoden att alla Saccharibacteria är tillräckligt små för att passera genom ett 0,2 μm-filter. Det kan vara så att andra Saccharibacteria är större än man trott och filtret väljer mot dessa organismer. Ett filter med större porstorlek skulle kunna användas, men detta riskerar att släppa in mer oönskade orala bakterier i den infekterade samkulturen. Slutligen är det mycket svårt att hitta värdarter utanför de som redan har publicerats. Hittills är de enda framgångsrika värdarna arter från släktena Actinomyces, Schaalia, Arachnia och Cellulosimicrobium, alla medlemmar av fylum actinobacteria15,17,18. Dessa värdar stöder dock bara tillväxten av specifika Saccharibacteria. För att odla fler arter av Saccharibacteria måste många fler värdar utforskas.
Vi hoppas att den metod som presenteras här kommer att bidra till framtida forskning av Saccharibacteria och andra HLR-organismer. Metagenomisk sekvensering tyder på att dessa organismer också har små genom och misstänks vara symbionter eller förlita sig på det lokala mikrobiella samhället för att leverera metaboliter och andra faktorer som är kritiska för deras överlevnad19. En liknande filtreringsstrategi skulle kunna användas för att isolera dessa organismer, förutsatt att de är tillräckligt små och att deras värdorganismer kan odlas. De metoder som beskrivs här är ett första steg för att föra laboratoriekulturens kraftfulla verktyg till denna stora och mångsidiga grupp bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He och Batbileg Bor för hjälpsamma diskussioner och för att de tillhandahåller bakteriestammar. Vi tackar Susan Yost och Jessica Woods för mikrobiell teknisk hjälp. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) och T32 DE007327 (AJC). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |