Her beskriver vi hvordan du bruker de automatiserte makromolekylære krystallografirørledningene til protein-til-struktur, rask ligandproteinkompleksanalyse og storskala fragmentscreening basert på CrystalDirect-teknologien ved HTX Laboratory i EMBL Grenoble.
EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), et stort brukeranlegg som tilbyr krystallografitjenester med høy gjennomstrømning til brukere over hele verden. HTX-laboratoriet har et sterkt fokus på utvikling av nye metoder innen makromolekylær krystallografi. Gjennom kombinasjonen av en høy gjennomstrømningskrystalliseringsplattform har CrystalDirect-teknologien for helautomatisk krystallmontering og kryoisolering og CRIMS-programvaren vi har utviklet helautomatiske rørledninger for makromolekylær krystallografi som kan fjernstyres over internett. Disse inkluderer en protein-til-struktur rørledning for bestemmelse av nye strukturer, en rørledning for rask karakterisering av protein-ligand komplekser til støtte for medisinsk kjemi, og en storskala, automatisert fragmentscreening rørledning som muliggjør evaluering av biblioteker på over 1000 fragmenter. Her beskriver vi hvordan du får tilgang til og bruker disse ressursene.
Automatisering har blitt introdusert i alle trinn i den makromolekylære krystallografi eksperimentelle prosessen, fra krystallisering til diffraksjonsdatainnsamling og prosessering1,2,3,4,5,6,7,8,9, inkludert en rekke teknologier for prøvemontering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Dette har ikke bare akselerert tempoet som krystallografiske strukturer oppnås, men har bidratt til å strømlinjeforme applikasjoner som strukturstyrt legemiddeldesign18,19,20,21,22,23,24. I dette manuskriptet beskriver vi noen av aspektene ved de automatiserte krystallografirørledningene som er tilgjengelige på HTX-laboratoriet i Grenoble, samt de underliggende teknologiene.
HTX-laboratoriet ved EMBL Grenoble er et av de største akademiske anleggene for krystalliseringsscreening i Europa. Det er samlokalisert på European Photon and Neutron (EPN) campus sammen med European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), som produserer noen av verdens mest briljante røntgenstråler og Institut Laue Langevin (ILL), som gir høyfluks nøytron bjelker. Siden oppstarten i 2003 har HTX-laboratoriet levert tjenester til over 800 forskere og behandler mer enn 1000 prøver per år. HTX-laboratoriet har et sterkt fokus på utvikling av nye metoder innen makromolekylær krystallografi, inkludert metoder for prøveevaluering og kvalitetskontroll25,26 og CrystalDirect-teknologien, noe som muliggjør helautomatisk krystallmontering og prosessering15,16,17. HTX-laboratoriet har også utviklet Crystallographic Information Management System (CRIMS), et nettbasert laboratorieinformasjonssystem som gir automatisert kommunikasjon mellom krystallisering og synkrotron datainnsamlingsanlegg, noe som muliggjør uavbrutt informasjonsflyt over hele prøvesyklusen fra rent protein til diffraksjonsdata. Gjennom kombinasjonen av kapasiteten til HTX-anlegget, CrystalDirect-teknologien og CRIMS-programvaren har vi utviklet helautomatiske protein-til-struktur-rørledninger som integrerer krystalliseringsscreening, krystalloptimalisering, automatisert krystallhøstingsbehandling og kryooling og røntgendatainnsamling ved flere synkrotroner i en enkelt og kontinuerlig arbeidsflyt som kan betjenes eksternt gjennom en nettleser. Disse rørledningene kan brukes til å støtte rask bestemmelse av nye strukturer, karakterisering av protein-ligandkomplekser og storskala sammensatt og fragmentscreening gjennom røntgenkrystallografi.
HTX-laboratoriet er utstyrt med en ikke-volum krystalliseringsrobot (inkludert en LCP-modul som muliggjør krystallisering av både oppløselige og membranproteiner), krystall gårder (ved 5 °C og 20 °C), to robotiserte væskehåndteringsstasjoner for å forberede krystalliseringsskjermer og to automatiserte CrystalDirect-krystallhøstere med kapasitet til å produsere og lagre opptil 400 frosne prøvepinner per driftssyklus. Forskere sender sine prøver til anlegget med ekspresskurer, som deretter behandles av dedikerte teknikere på HTX-laboratoriet. Forskere kan eksternt designe krystalliseringsscreening og optimaliseringseksperimenter gjennom et webgrensesnitt levert av CRIMS-systemet. Gjennom dette grensesnittet kan de velge mellom et bredt spekter av parametere og eksperimentelle protokoller som er tilgjengelige på anlegget for å passe til deres spesifikke utvalgskrav. Resultater sammen med alle eksperimentelle parametere gjøres tilgjengelig for brukere i sanntid gjennom CRIMS. Alle mottatte prøver er analysert gjennom en spesielt utviklet metode som gjør det mulig å estimere krystalliseringssannsynligheten forprøven 25,26,27. Basert på resultatene av denne analysen er det gitt spesifikke anbefalinger til brukere om optimal inkubasjonstemperatur og mulige prøveoptimaliseringsforsøk. Når krystalliseringseksperimenter er satt opp, kan forskeren evaluere resultatene ved å se på krystalliseringsbilder samlet på forskjellige tidspunkter via nettet. Når krystaller som er egnet for røntgendiffraksjonseksperimenter identifiseres, kan forskere bruke et dedikert grensesnitt for å etablere en krystallmonteringsplan som deretter utføres av CrystalDirect-roboten.
CrystalDirect-teknologien er basert på bruk av en modifisert dampdiffusjonskrystallisasjonsmikroplate og en laserstråle for å montere og kryokjøle krystallprøver i diffraksjonskompatible støtter lukking av automatiseringsgapet som eksisterer mellom krystallisering og datainnsamling15,16,17. Kort sagt dyrkes krystaller i en modifisert dampdiffusjonsplate, CrystalDirect-mikroplaten. Når krystaller vises, bruker CrystalDirect-høstingsroboten automatisk en laserstråle for å skille ut et filmstykke som inneholder krystallen, feste den til en standard diffraction-datainnsamlingspinne og kryokjøle den i en nitrogengassstrøm (se Zander et al. 2016 og https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denne teknologien har en rekke ekstra fordeler i forhold til manuelle eller halvautomatiske krystallmonteringsprotokoller. For eksempel er krystallenes størrelse og form ikke et problem, noe som gjør det like enkelt å høste store krystaller eller mikrokrystaller, det er ofte mulig å unngå bruk av kryo-beskyttere, på grunn av den spesielle måten teknologien opererer på (se referanse 17, Zander et al.), noe som gjør røntgendiffraksjonsanalyse mye enklere. Laserstrålen kan også brukes som et kirurgisk verktøy for å velge de beste delene av en prøve når krystaller vokser på klynger eller viser epitoksial vekst for eksempel. CrystalDirect-teknologien kan også brukes til automatiserte bløtleggingsforsøk17. Levering av løsninger med små molekyler eller andre kjemikalier til krystaller. Dermed gjør det mulig å støtte helautomatisk, storskala sammensatt og fragmentscreening. Når krystaller høstes og kryoisoleres av CrystalDirect-roboten, overføres de til enten SPINE- eller Unipuck-pucker som er kompatible med de fleste synkrone makromolekylære krystallografistrålelinjer rundt om i verden. Systemet kan høste opptil 400 pinner (kapasiteten til den kryogene lagringen Dewar) på en helt autonom måte. CRIMS kommuniserer med innhøstingsroboten under prosessen og gir automatisert sporing av krystallprøver (pucker og pinner). Pucks er merket med både strekkoder og RFID-brikker for å lette prøvehåndtering21,28.
CRIMS tilbyr et API (Application Program Interface) som støtter automatisert kommunikasjon med ISPyB-systemet som støtter administrasjon og behandling av røntgendatainnsamling ved mange synkrotroner i Europa og verden29. Etter at automatisert krystallhøsting er fullført, kan forskere velge krystallprøver (pucks) og lage prøveforsendelser for de makromolekylære krystallografistrålene på enten ESRF (Grenoble, Frankrike)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS overfører dataene som tilsvarer de valgte strålelinjeprøvene, til synkrotroninformasjonssystemet sammen med forhåndsvalgte datainnsamlingsparametere. Når prøvene ankommer den valgte synkrotronstrålelinjen, utføres røntgendatainnsamling enten manuelt, gjennom fjernstrålelinjedrift eller på en helautomatisk måte (dvs. ved MASSIF-1-strålelinjen til ESRF8 som drives av den felles EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Etter datainnsamling henter CRIMS automatisk informasjon om resultatene av datainnsamling sammen med innledende databehandlingsresultater utført av synkrotrondatabehandlingssystemene og presenterer den for forskeren gjennom et praktisk brukergrensesnitt.
HTX-laboratoriet bruker disse automatiserte rørledningene for å støtte tre forskjellige applikasjoner, raske bestemmelser av nye strukturer, rask karakterisering av protein-ligandkomplekser og storskala sammensatt og fragmentscreening. Nedenfor beskriver vi hvordan du bruker og betjener dem.
De automatiserte krystallografirørledningene som er beskrevet her, er tilgjengelige for forskere over hele verden gjennom forskjellige finansieringsprogrammer. For tiden kan finansiert tilgang for krystalliseringseksperimenter og CrystalDirect-teknologien oppnås ved å søke på iNEXT Discovery-programmet og INSTRUCT-ERIC, mens tilgang til makromolekylære krystallografistråler på ESRF støttes gjennom ESRF-brukertilgangsprogrammet. Denne tilnærmingen minimerer forsinkelsen mellom krystallvekst og måling, akselererer progresjonen av svært utfordrende prosjekter som krever diffraksjonsbasert optimalisering av proteinproduksjon og krystalliseringsforhold og frigjør forskere fra komplekse operasjoner forbundet med krystallisering, krystallhåndtering og strålelinjedrift, noe som gjør krystallografi mer tilgjengelig for ikke-ekspertgrupper. Den kan også brukes til rask utforskning av krystalliseringstilsetningsstoffer, fasingsmidler eller for sammensatt screening gjennom kokrystalliseringseksperimenter. Selv om de fleste krystallografiprosjekter potensielt kan dra nytte av denne tilnærmingen, kan noen prøver kreve spesielle protokoller som ikke kan brukes til automatisering eller rørledninger som presenteres her, for eksempel de som krever mikrofluidiske systemer eller høyt spesialiserte krystalliseringsenheter eller prøver som er ekstremt labile og ikke vil tolerere forsendelse.
CrystalDirect-teknologien muliggjør også automatisert krystall-soaking17 for karakterisering av små molekylmålkomplekser. For dette opprettes en liten blenderåpning med laseren før høstingsprosessen og en dråpe av en løsning som inneholder de ønskede kjemikaliene (dvs. fasingmidler eller potensielle ligander) tilsettes på toppen, slik at den kommer i kontakt med, og diffuserer inn i krystalliseringsløsningen som til slutt når krystallen. Kjemiske løsninger kan formuleres i vann, DMSO eller andre organiske løsningsmidler. Etter en viss inkubasjonstid kan krystallene høstes og analyseres ved diffraksjon som beskrevet ovenfor. Denne tilnærmingen har blitt brukt på rask karakterisering av ligandproteinkomplekser i sammenheng med strukturbasert legemiddeldesign samt til storskala sammensatt og fragmentscreening. I sistnevnte tilfelle kan fragmentbiblioteker med hundrevis til over tusen fragmenter raskt analyseres. Spesifikke CRIMS-grensesnitt som ikke presenteres her, letter design og automatisert sporing av krystall-soaking-eksperimenter, mens integrasjon mellom CRIMS-programvaren og Pipedream-programvarepakken, utviklet av Global Phasing Ltd (Storbritannia) muliggjør automatisert databehandling, fasing, ligandidentifikasjon og strukturforbedring over hundrevis av datasett parallelt, effektiviserer dataanalyse og tolkning32,33 . For eksempel ble denne rørledningen nylig brukt på identifisering av fragmenter som binder seg både til det aktive stedet og flere allosteriske steder i Trypanosoma brucei farnesyl pyrofosfatsyntase, et viktig enzym av parasitten som forårsaker menneskelig afrikansk trypanosomiasis.
Rørledningene som presenteres her kan bidra til å akselerere oppdagelsestakten i strukturbiologien og gjøre makromolekylær krystallografi mer tilgjengelig for et større antall forskningsgrupper. Ved å legge til rette for storskala sammensatt og fragmentscreening kan de dessuten bidra til å fremme translasjonell forskning og fremskynde prosessen med narkotikaoppdagelse, noe som bidrar til å lette utviklingen av bedre og tryggere stoffer mot et større antall mål.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke den felles EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) for støtte i bruk og drift av ESRF makromolekylære bjelker. Vi er takknemlige til Matthew Bowler for støtte med datainnsamling på MASSIF-1-strålelinjen til ESRF og Thomas Schneider og EMBL Hamburg Team for utmerket støtte med datainnsamling på P14 av PetraIII synchrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-innhøstingen er utviklet i samarbeid med Instrumentation Team ved EMBL Grenoble. Dette prosjektet ble støttet av midler fra European CommunityH2020 Program under prosjektene iNEXT (Grant No 653706) og iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes gjennom Booster-programmet.
CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |