In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien
Summary
Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).
Abstract
Ab dem Jahr 2000 stand der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll zur Behandlung von Typ-I-Diabetes mellitus immer noch vor einigen Hindernissen. Dazu gehören die begrenzte Anzahl von Leichenspendern und die langfristige Verwendung von Immunsuppressiva. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als potenzieller Kandidat als alternative Quelle für inselähnliche Zellgenerierung angesehen. Unsere früheren Berichte haben erfolgreich die Etablierung von Induktionsprotokollen zur Unterscheidung von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) zu insulinproduzierenden Zellen (IPCs) veranschaulicht. Die Induktionseffizienz variierte jedoch stark. In diesem Artikel demonstrieren wir den Vergleich der Pankreasinduktionseffizienz von hDPSCs über integrative (mikroökumweltliche und genetische Manipulation) und nicht-integrative (mikroökumvimentale Manipulation) Induktionsprotokolle zur Bereitstellung von hDPSC-abgeleiteten IPCs (hDPSC-IPCs). Die Ergebnisse deuten auf eine unterschiedliche Induktionseffizienz für beide Induktionsansätze in Bezug auf 3-dimensionale Koloniestruktur, Ausbeute, Pankreas-mRNA-Marker und funktionelle Eigenschaften bei Multidosis-Glukose-Herausforderung hin. Diese Ergebnisse werden die zukünftige Etablierung einer klinisch anwendbaren IPCs und einer Produktionsplattform für Pankreaslinien unterstützen.
Introduction
Diabetes mellitus ist ein anhaltendes globales Problem. Ein Bericht der International Diabetes Federation (IDF) schätzte, dass die globale Prävalenz von Diabetes von 151 Millionen im Jahr 2000 auf 415 Millionen im Jahr 2015 steigen würde1,2. Die jüngste epidemiologische Studie hat vorhergesagt, dass die geschätzte weltweite Diabetesprävalenz von 451 Millionen im Jahr 2017 auf 693 Millionen im Jahr 2045 steigen wird1. Der Erfolg der Pankreas-Inseltransplantation mit dem Edmonton-Protokoll wurde erstmals im Jahr 2000 nachgewiesen, als gezeigt wurde, dass sie die endogene Insulinproduktion aufrechterhält und den normoglykämischen Zustand bei Typ-I-Diabetikern stabilisiert3. Die Anwendung des Edmonton-Protokolls steht jedoch immer noch vor einem Engpassproblem. Die begrenzte Anzahl von Leichenspendern ist das Hauptproblem, da jeder Patient mit Typ-I-Diabetes mindestens 2-4 Inselspender benötigt. Darüber hinaus kann die langfristige Anwendung von Immunsuppressiva lebensbedrohliche Nebenwirkungen verursachen4,5. Um dies zu beheben, hat sich die Entwicklung einer potenziellen Therapie für Diabetes in den letzten zehn Jahren hauptsächlich auf die Erzeugung wirksamer insulinproduzierender Zellen (IPCs) aus verschiedenen Quellen von Stammzellen konzentriert6.
Stammzellen wurden zu einer alternativen Behandlung bei vielen Krankheiten, einschließlich Diabetes Typ I, der durch den Verlust von Beta-Zellen verursacht wird. Die Transplantation von IPCs ist die neue vielversprechende Methode zur Kontrolle des Blutzuckers bei diesen Patienten7. Zwei Ansätze zur Erzeugung von IPCs, integrative und nicht-integrative Induktionsprotokolle, werden in diesem Artikel vorgestellt. Das Induktionsprotokoll ahmte den natürlichen Entwicklungsprozess der Bauchspeicheldrüse nach, um die ausgereiften und funktionellen IPCs8,9zu erhalten.
Für diese Studie wurden hDPSCs durch Durchflusszytometrie für die MSC-Oberflächenmarkerdetektion, das Multilineage-Differenzierungspotenzial und RT-qPCR charakterisiert, um die Expression der Stemness-Eigenschaft und der proliferativen Genmarker zu bestimmen (Daten nicht gezeigt)8,9,10. hDPSCs wurden zu definitiven Endoderm-, Pankreasendoderm-, endokrinen Pankreas- und Pankreas-Betazellen oder IPCs induziert (Abbildung 1) bzw.7. Um die Zellen zu induzieren, wurde ein dreistufiger Induktionsansatz als Backbone-Protokoll verwendet. Dieses Protokoll wurde als nicht-integratives Protokoll bezeichnet. Im Falle des integrativen Protokolls wurde der essentielle Pankreas-Transkriptionsfaktor PDX1in hDPSCs überexprimiert, gefolgt von der Induktion von überexprimiertem PDX1 in hDPSCs unter Verwendung eines dreistufigen Differenzierungsprotokolls. Der Unterschied zwischen nicht-integrativem und integrativem Protokoll ist die Überexpression von PDX1 im integrativen Protokoll und nicht im nicht-integrativen Protokoll. Die Pankreasdifferenzierung wurde in dieser Studie zwischen den integrativen und nicht-integrativen Protokollen verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Erreichen einer höheren IPCs-Produktion aus MSCs spielt eine wesentliche Rolle in der Diabetestherapie. Die kritischen Schritte des integrativen Protokolls hängen von der Qualität der für die Transduktion zu verwendenden Zellen und der Qualität der transduzierten Zellen ab. Einige Zellanforderungen, die auf eine erfolgreiche Transduktion überprüft werden sollten, stellen sicher, dass sich die Zellgesundheit, das Zellbankmanagement und die Zellen in einem mitotisch aktiven Zustand befinden. Darüber hinaus spie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SK, WR und QDL wurden von der Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University, unterstützt. TO und PP wurden von Chulalongkorn Academic Advancement in Its2nd Century Project unterstützt. CS wurde durch ein forschungsunterstützendes Stipendium der Fakultät für Veterinärwissenschaften, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University und Government Research Fund unterstützt.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referências
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton’s jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
