Introduksjon Induksjon av humane dentalmasse stamceller mot bukspyttkjertelen avstamninger
Summary
Denne protokollen presenterer en sammenligning mellom to forskjellige induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCer) mot bukspyttkjertel avstamninger in vitro: den integrerende protokollen og den ikke-integrative protokollen. Den integrerte protokollen genererer flere insulinproduserende celler (IPCer).
Abstract
Fra og med 2000 sto suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen for å behandle type I diabetes mellitus fortsatt overfor noen hindringer. Disse inkluderer det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer og langvarig bruk av immundempende midler. Mesenchymale stamceller (MSCer) har blitt ansett for å være en potensiell kandidat som en alternativ kilde til holmelignende cellegenerering. Våre tidligere rapporter har med hell illustrert etableringen av induksjonsprotokoller for differensiering av humane tannmasse stamceller (hDPSCs) til insulinproduserende celler (IPCer). Induksjonseffektiviteten varierte imidlertid sterkt. I dette dokumentet demonstrerer vi sammenligningen av hDPSCs pankreatisk induksjonseffektivitet via integrativ (mikroenvironmental og genetisk manipulering) og ikke-integrativ (mikroenvironmental manipulering) induksjonsprotokoller for å levere hDPSC-avledede IPCer (hDPSC-IPCer). Resultatene antyder tydelig induksjonseffektivitet for både induksjonsmetodene når det gjelder 3-dimensjonal kolonistruktur, utbytte, bukspyttkjertel mRNA-markører og funksjonell egenskap ved multidosering glukoseutfordring. Disse funnene vil støtte fremtidig etablering av en klinisk anvendelig IPC og bukspyttkjertellinjeproduksjonsplattform.
Introduction
Diabetes mellitus er en pågående global bekymring. En rapport fra International Diabetes Federation (IDF) anslo at den globale forekomsten av diabetes ville øke fra 151 millioner i 2000 til 415 millioner i 20151,2. Den siste epidemiologibaserte studien har spådd at den estimerte verdensomspennende diabetesprevalensen vil øke fra 451 millioner i 2017 til 693 millioner i 20451. Suksessen med bukspyttkjertel holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen ble først demonstrert i 2000, da det ble vist å opprettholde endogen insulinproduksjon og stabilisere den normoglykemiske tilstanden hos type I diabetikere3. Imidlertid står anvendelsen av Edmonton-protokollen fortsatt overfor et flaskehalsproblem. Det begrensede antallet kadaveriske bukspyttkjerteldonorer er hovedproblemet siden hver pasient med type I diabetes krever minst 2-4 holmedonorer. Videre kan langvarig bruk av immundempende midler forårsake livstruende bivirkninger4,5. For å løse dette har utviklingen av en potensiell terapi for diabetes det siste tiåret hovedsakelig fokusert på generering av effektive insulinproduserende celler (IPCer) fra ulike kilder tilstamceller 6.
Stamceller ble en alternativ behandling i mange sykdommer, inkludert diabetes type I, som skyldes tap av betaceller. Transplantasjon av IPCer er den nye lovende metoden for å kontrollere blodsukker hos disse pasientene7. To tilnærminger for å generere IPCer, integrative og ikke-integrative induksjonsprotokoller, presenteres i denne artikkelen. Induksjonsprotokollen etterlignet den naturlige utviklingsprosessen for bukspyttkjertelen for å få de modne og funksjonelle IPCene8,9.
For denne studien var hDPSCer preget av strømningscytometri for MSC-overflatemarkørdeteksjon, multilineage differensieringspotensial og RT-qPCR for å bestemme uttrykket av stemnessegenskap og proliferative genmarkører (data ikke vist)8,9,10. hDPSCer ble indusert mot definitiv endoderm, bukspyttkjertel endoderm, bukspyttkjertel endokrine og bukspyttkjertel beta-celler eller IPCer (Figur 1), henholdsvis7. For å indusere cellene ble en tre-trinns induksjonstilnærming brukt som en ryggradsprotokoll. Denne protokollen ble kalt en ikke-integrativ protokoll. Når det gjelder integrativ protokoll, ble den essensielle transkripsjonsfaktoren for bukspyttkjertelen, PDX1, overekspressert i hDPSCer etterfulgt av induksjon av overutpresset PDX1 i hDPSCer ved hjelp av en tretrinns differensieringsprotokoll. Forskjellen mellom ikke-integrativ og integrativ protokoll er overekspressering av PDX1 i integrativ protokoll og ikke i den ikke-integrative protokollen. Pankreasdifferensiering ble sammenlignet mellom de integrative og ikke-integrative protokollene i denne studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å oppnå høyere IPC-produksjon fra MSCer spiller en viktig rolle i diabetesbehandling. De kritiske trinnene i den integrative protokollen er avhengige av kvaliteten på cellene som skal brukes til transduksjon og kvaliteten på transinduserte celler. Noen cellekrav som bør kontrolleres for vellykket transduksjon, sikrer cellehelse, cellebankstyring og celler er i mitotisk aktiv tilstand. Videre spiller overvåking av levedyktigheten til transinduserte celler også en viktig rolle. Mindre vellykket transduksjon er for?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SK, WR og QDL ble støttet av Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO og PP ble støttet av Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project. CS ble støttet av et forskningsstøttende stipend fra Fakultet for veterinærvitenskap, Chulalongkorn Academic Advancement into Its2 nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University og Government Research Fund.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referências
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants. Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).
- Diabetes Care. Minimizing hypoglycemia in diabetes. Diabetes Care. 38 (8), 1583 (2015).
- Health Quality Ontario. Islet transplantation: an evidence-based analysis. Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).
- Brennan, D. C., et al. Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).
- Korsgren, O. Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations. Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).
- Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice. Frontiers in Veterinary Science. 7, 4 (2020).
- Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).
- Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).
- Kuncorojakti, S., et al. Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells. Journal of Biological Engineering. 14, 23 (2020).
- Ritz-Laser, B., et al. Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription. Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).
- Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).
- Fraga, M., et al. Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model. International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).
- Balak, J. R. A., et al. Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells. Scientific Reports. 9 (1), 15870 (2019).
- Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage. Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).
- Spaeth, J. M., et al. Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning. Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).
- Bastidas-Ponce, A., et al. Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells. Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).
- Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240 (2017).
- Ma, D., et al. Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172 (2017).
- Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis. Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).
- Xu, B., et al. Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 1576 (2019).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
- Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. Notch signaling in pancreatic development. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48 (2015).
- Motoyama, H., et al. Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells. PLoS One. 13 (5), 0197175 (2018).
- Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture. Scientific Reports. 9 (1), 4040 (2019).
- Wedeken, L., et al. Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture. Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).
- Trott, J., et al. Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).
- Kim, J. S., et al. Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).
- Gauthaman, K., et al. Extra-embryonic human Wharton’s jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).
- Schiesser, J. V., Wells, J. M. Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet. Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).
- Chmielowiec, J., Borowiak, M. In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors. The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).
