In vitro Indução de células-tronco de polpa dentária humanas em direção a linhagens pancreáticas
Summary
Este protocolo apresenta uma comparação entre dois protocolos de indução diferentes para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em relação a linhagens pancreáticas in vitro: o protocolo integrativo e o protocolo não integrativo. O protocolo integrativo gera mais células produtoras de insulina (IPCs).
Abstract
A partir de 2000, o sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas usando o protocolo de Edmonton para tratar diabetes mellitus tipo I ainda enfrentou alguns obstáculos. Estes incluem o número limitado de doadores cadavéricos do pâncreas e o uso a longo prazo de imunossupressores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido consideradas como um candidato em potencial como uma fonte alternativa de geração celular semelhante a ilhotas. Nossos relatórios anteriores ilustraram com sucesso o estabelecimento de protocolos de indução para diferenciar células-tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) em células produtoras de insulina (IPCs). No entanto, a eficiência da indução variou muito. Neste artigo, demonstramos a comparação da eficiência da indução pancreática do HDPSCs por meio de protocolos integrativos (manipulação microambiental e genética) e não integrativos (manipulação microambiental) para a entrega de IPCs derivados do HDPSC (hDPSC-IPCs). Os resultados sugerem uma eficiência de indução distinta tanto para as abordagens de indução em termos de estrutura de colônia tridimensional, rendimento, marcadores de mRNA pancreático e propriedade funcional no desafio de glicose multidosagem. Esses achados apoiarão o futuro estabelecimento de um IPC clinicamente aplicável e uma plataforma de produção de linhagem pancreática.
Introduction
Diabetes mellitus é uma preocupação global em curso. Um relatório da Federação Internacional de Diabetes (IDF) estimou que a prevalência global de diabetes aumentaria de 151 milhões em 2000 para 415 milhões em 20151,2. O último estudo baseado em epidemiologia previu que a prevalência estimada mundial de diabetes aumentará de 451 milhões em 2017 para 693 milhões em 20451. O sucesso do transplante de ilhotas pancreáticas utilizando o protocolo de Edmonton foi demonstrado pela primeira vez em 2000, quando foi demonstrado manter a produção endógena da insulina e estabilizar a condição normóglicêica em pacientes diabéticos tipo I3. No entanto, a aplicação do protocolo de Edmonton ainda enfrenta um problema de gargalo. O número limitado de doadores de pâncreas cadavérico é o principal problema, uma vez que cada paciente com diabetes tipo I requer pelo menos 2-4 doadores de ilhotas. Além disso, o uso a longo prazo de agentes imunossupressores pode causar efeitos colaterais fatais4,5. Para lidar com isso, o desenvolvimento de uma potencial terapia para diabetes na última década tem focado principalmente na geração de células eficazes produtoras de insulina (IPCs) de várias fontes de células-tronco6.
As células-tronco tornaram-se um tratamento alternativo em muitas doenças, incluindo o diabetes tipo I, que é causado pela perda de células beta. O transplante de IPCs é o novo método promissor para o controle da glicemia nesses pacientes7. Neste artigo, estão apresentadas duas abordagens para geração de IPCs, protocolos integrativos e não integrativos de indução. O protocolo de indução imitou o processo natural de desenvolvimento pancreático para obter os IPCs amadurecidos e funcionais8,9.
Para este estudo, os hDPSCs foram caracterizados por citometria de fluxo para detecção de marcadores de superfície MSC, potencial de diferenciação de multilineagem e RT-qPCR para determinar a expressão da propriedade stemness e marcadores genéticos proliferativos (dados não mostrados)8,9,10. hDPSCs foram induzidos em direção ao endoderme definitivo, endóderme pancreático, endócrina pancreática e células beta pancreáticas ou IPCs(Figura 1), respectivamente7. Para induzir as células, uma abordagem de indução de três etapas foi usada como protocolo de espinha dorsal. Este protocolo foi chamado de protocolo não integrativo. No caso do protocolo integrativo, o fator essencial de transcrição pancreática, PDX1,foi superexpresso em hDPSCs seguido pela indução de PDX1 superexpresso em hDPSCs utilizando um protocolo de diferenciação de três etapas. A diferença entre protocolo não integrativo e integrativo é a superexpressão do PDX1 no protocolo integrativo e não no protocolo não integrativo. A diferenciação pancreática foi comparada entre os protocolos integrativos e não integrativos deste estudo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcançar maior produção de IPCs de MSCs desempenha um papel essencial na terapia do diabetes. As etapas críticas do protocolo integrativo dependem da qualidade das células a serem utilizadas para a transdução e a qualidade das células transduzidas. Alguns requisitos celulares que devem ser verificados para uma transdução bem-sucedida estão garantindo a saúde celular, o gerenciamento de bancos celulares e as células estão em um estado mitoticamente ativo. Além disso, o monitoramento da viabilidade das célu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SK, WR e QDL foram apoiados pela Unidade veterinária de pesquisa de células-tronco e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO e PP foram apoiados pelo Avanço Acadêmico de Chulalongkorn em seu projeto do séculoII. CS foi apoiado por uma pesquisa apoiando a bolsa da Faculdade de Ciência Veterinária, o Avanço Acadêmico chulalongkorn em seu projeto do século2, unidade de pesquisa de células-tronco veterinárias e bioengenharia, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University e Government Research Fund.
Materials
| Cell Culture | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific Corporation, USA | 15240062 | |
| Corning® 60 mm TC-treated Culture Dish | Corning® | 430166 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) powder, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | One pack is used for preparing 1 L of PBS solution with sterile DDI |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation | |||
| Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter | Merck Millipore, USA | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 plasmid | Addgene | 12256 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256 |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | Gift from Didier Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260 |
| Three-step Induction Protocol | |||
| Activin A Recombinant Human Protein | Merck Millipore | GF300 | |
| Beta-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| Bovine serum albumin (BSA, Cohn fraction V, fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Glucagon-like peptide (GLP)-1 | Sigma-Aldrich | G3265 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAAs) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| Non-treated cell culture dish, 60mm | Eppendorf | 30701011 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Referências
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