巨核球分化と血小板形成を研究する細胞源としての白血病の枯渇フィルター由来CD34+細胞
Summary
このプロトコルは、ロイコフィルター由来CD34+造血前駆物質の取得に関与するすべてのステップと、培養培地中の血小板を放出することができる原血小板を持つ巨核球への それらの体外 分化および成熟について詳細に説明する。この手順は、巨核代を制御する細胞および分子機構の詳細な分析に有用である。
Abstract
ヒト造血前駆細胞を巨核球に分化し、プロ血小板を伸ばし、血小板を放出することができる インビトロ の拡大と分化により、血小板生物形成の根底にあるメカニズムの詳細な研究が可能になる。利用可能な培養プロトコルは、主に骨髄または臍帯血に由来する造血前駆物質に基づいており、倫理的、技術的、経済的な懸念の数を提起する。末梢血からCD34細胞を得るためのプロトコルが既に利用可能な場合、この原稿は、血液中枢で容易に入手可能な白血病減少フィルターからCD34+細胞を得るための簡単で最適化されたプロトコルを提案する。これらの細胞は、輸血製品の調製に使用される白血病枯渇フィルターから単離され、8つの献血に対応する。これらのフィルタは破棄されます。これらのフィルターからCD34+細胞として同定された造血前駆物質を収集する詳細な手順について説明する。プロメトレットを伸ばす成熟した巨核球を得る方法についても詳しく述べています。最後に、このプロトコルは、較正されたピペット法を提示し、形態学的および機能的に天然のものと類似した血小板を効率的に放出する。このプロトコルは、基礎となるメカニズムを解剖し、 インビボ 血小板収量に近づくプロセスの様々なステップで作用する薬理学的化合物を評価するための基礎として役立つことができる。
Introduction
血小板は、巨核球(MKP)として知られている一定の微調整された生産プロセスに由来する特殊な大きな多倍体細胞、巨核球(MK)から来ます。このプロセスの頂点には、骨髄環境(サイトカイン、転写因子、造血ニッチ)と接触して、巨核球体経路に向かってコミットできる造血前駆体(HP)に増殖し、分化することができる造血幹細胞があります。MKPの主要なサイトカインである様々なサイトカイン、特にトロンボポエチン(TPO)の影響を受ける。MKは成熟の2つの主要な段階を受ける:エンドミドーシスと境界膜(DMS)の開発。この完全に成熟したMKは、血液の流れの下で放出され、その後機能血小板2に改造される細胞質拡張、プロ血小板を放出することができるシヌソード血管の近くに現れる。1994年のTPOのクローニングは、HP の分化とMK成熟を可能にする インビトロ 培養技術の開発を加速させることによって、MKPの研究を後押しした。
血小板に影響を与える多くの病理があり、血小板数(増減)と機能4、5の両方の点で。ヒトHPから生体外でMKPを再現できることは、このプロセスの根底にある分子および細胞メカニズムの理解を深め、最終的には患者の治療管理を改善することができる。
ヒトHPのさまざまな供給源が適している:臍帯血、骨髄、および末梢血6、7、8。末梢血からHPを収穫することは臍帯血または骨髄からの回復より少ない物流および倫理的問題を提起する。HPは、白血病やバフィーコートから回収することができますが、これらの供給源は高価であり、常に血液中枢で利用可能であるとは限りません。他のプロトコルは、より安価で実行しやすく、以前のCD34駆動隔離4、8を必要とせずにヒト末梢血単核細胞(PBMC)を直接回復することを可能にする。しかし、この方法では巨核球の純度は満足のいくものではなく、MKへの最適な分化にはPBMCからCD34+細胞を選択することが推奨されています。これにより、白血球を除去し、免疫反応の悪性を避けるために血液バンクで日常的に使用される、白血病低減フィルター(LRF)からのHP精製を実施するに至った。確かに、1998年以来、フランスでは血小板濃縮物が自動的に白血病になってきた。このプロセスの終了時に、LRF は廃棄され、LRF に保持されているすべてのセルが破棄されます。したがって、LDF 内のセルは、追加コストなしで容易に利用できます。LDFは、白血病またはバフィーコートによって得られたものに近い細胞含有量を有し、特にCD34+HPの組成において、著しく魅力的なソース10を作る。ヒトHP源としてのLRFは、細胞に無傷の機能能力11を提供することが既に実証されている。このソースは、豊富で、実験室の研究のための手頃な価格であることの利点を持っています.この記事では、この資料では、続いて説明します: i) 抽出と LIF から CD34+ HP の選択;ii) 二相最適化培養, 巨核球経路へのHPのコミットメントとプロ血トを放出することができるMKの成熟;iii) これらのMKから血小板を効率よく放出する方法;iv) MKおよび培養血小板のフェノタイピングの手順。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、血液由来HPからプロ血小板を放出し、培養培地から血小板を放出することができるMKを産生する方法を説明する。HPは、細胞血液産物から汚染された白血球を除去し、有害反応を避けるために使用される血液バンクの副産物であるLRFから得られる。この方法は比較的簡単ですが、いくつかの点は特別な注意を払うに値します。
密度勾配媒体上の細胞懸?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ANR(アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ)グラントANR- 17-CE14-0001-1によってサポートされています。
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
Referências
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