Burada açıklanan, hücresel inhibitör protein SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının derecesini belirlemek için kurulmuş bir yöntemdir. İnsan miyeloid soy U937 hücreleri, YFP’yi birlikte eksprese eden bir SAMHD1 ekspresyon vektörü ile dönüştürülür, farklılaştırılır ve daha sonra HIV-RFP ile zorlanır. Kısıtlama seviyesi akım sitometri analizi ile belirlenir.
Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), sessiz miyeloid hücrelerde HIV-1’in replikasyonunu inhibe eder. U937 hücreleri, düşük seviyede SAMHD1 RNA ekspresyonu nedeniyle SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılır ve bu da tespit edilemeyen endojen protein ekspresyonuna yol açar. Diğer retroviral kısıtlama faktörlerini karakterize etmek için Stoye laboratuvarında geliştirilen benzer testlere dayanarak, Bishop laboratuvarı U937 hücrelerinde SAMHD1’i analiz etmek için iki renkli bir kısıtlama testi geliştirdi. Murin Lösemi SAMHD1’i eksprese eden virüs benzeri parçacıklar, bir IRES’ten ifade edilen YFP’nin yanı sıra, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat ile muamele edilir. Farklılaşmayı takiben, hücrelere floresan bir muhabiri ifade eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklar bulaşır. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve akış sitometrisi ile analiz edilir. SAMHD1 eksprese eden popülasyondaki HIV ile enfekte hücrelerin oranı, SAMHD1’den yoksun iç kontrol hücrelerindekiyle karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. SAMHD1 ekspresyonu, HIV enfeksiyonunda 0.2’lik bir kısıtlama oranına karşılık gelen beş kat azalmaya yol açar. Son zamanlarda HIV enfeksiyonu için muhabir gen olarak orijinal GFP yerine RFP’yi ikame etmemiz, akış sitometri analizini kolaylaştırmıştır.
Bu tahlil, amino asit ikamelerinin SAMHD1 kısıtlaması üzerindeki etkisini, ekspresyon vektörünün bölgeye yönelik mutagenezinden türetilen değiştirilmiş SAMHD1 proteinlerini kodlayan virüslerle dönüştürerek karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan ikameleri, kısıtlama aktivitesinin kaybolduğunu gösteren 1’lik bir kısıtlama fenotipi gösterir. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Tahlil, SAMHD1, hücre metabolik durumu ve viral kısıtlama arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için farklılaşma durumunun, metabolik durumun ve SAMHD1 değiştiricilerin etkisini içerecek şekilde daha da uyarlanabilir.
Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), miyeloid soyunun sessiz hücrelerinde İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü tip 1’in (HIV-1) replikasyonunu engeller. SAMHD1, bir dNTP trifosfohidrolaz olarak enzimatik aktivitesi yoluyla replikasyonu bloke eder, bu da hücre içi dNTP seviyelerinin azalmasına neden olur. Sonuç olarak, HIV-1 ters transkripsiyon işlemini verimli bir şekilde gerçekleştiremez. Bu ilk gözlemden bu yana geçen birkaç yıl içinde, özellikle spesifik alanların ve amino asitlerin SAMHD1’in antiviral aktivitesine katkısı konusunda çok ilerleme kaydedilmiştir. Bu içgörüler, biyokimyasal testlerin yanı sıra fizyolojik olarak ilgili sessiz miyeloid ortamını taklit eden hücre sistemleri kullanılarak yapılmıştır. U937 hücreleri1 , SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir miyeloid hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun nedeni, SAMHD1 ekspresyonuna kıyasla düşük RNA seviyelerine bağlı olduğu düşünülen endojen SAMHD1 ekspresyonunun eksikliğidir (devam eden bir araştırma alanı). Burada, protokol, SAMHD1’in SAMHD1 kısıtlamasının mekanizmasını incelemek için U937 hücrelerinin SAMHD1’i birlikte eksprese eden virüs benzeri parçacıklarla ve sarı bir floresan protein (YFP) muhabiriyle geçici transdüksiyonunu açıklamaktadır. Retroviral kısıtlamaları incelemek için bu tür geçici iki renkli akış sitometri testleri ilk olarak Stoye laboratuvarı2’de geliştirildi ve o zamandan beri üçlü motif (TRIM) proteinleri3 de dahil olmak üzere diğer kısıtlama faktörlerini araştırmak için uyarlandı. Bu tahlillerden esinlenen Bishop laboratuvarı, U937 hücrelerinde SAMHD1 kısıtlamasını analiz etmek için iki renkli bir test geliştirdi.
Deneyin iş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. Bir IRES’ten eksprese edilen YFP ile birlikte SAMHD1’i kodlayan bi-sistronik bir mesaj içeren Murin Lösemi Virüsü (MLV) benzeri parçacıklar, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat (PMA) ile muamele edilir. Hücreler daha sonra kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklarla enfekte olur. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve iki renkli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tahlil aynı zamanda YFP ve yeşil floresan protein (GFP) ile birlikte kullanılır ve akış sitometrisi analizi için daha az standart filtre kombinasyonu gerektirir. HIV-RFP kullanımı daha basit bir telafi sağlar ve böylece tahlil daha az deneyimli akış sitometrisi kullanıcıları için daha kolay erişilebilir ve çoğu sitometre ile elde edilebilir.
Analiz sırasında, HIV ile enfekte olmuş hücrelerin oranı, SAMHD1 eksprese eden hücreler ile aynı hücre kuyucuğunda SAMHD1’den yoksun olanlar arasında karşılaştırılır. Bu, iyi / akış sitometri tüpünde bir iç kontrol sağlar ve bu da önemli bir özelliktir. Transdüktif ve transdüe edilmemiş hücrelerdeki enfeksiyon düzeylerinin karşılaştırılması, bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. 1.0 oranı, transdüke faktörün bulaşıcılık üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir. Vahşi tip SAMHD1 ekspresyonu, bu tahlilde HIV enfeksiyonunda beş kat azalmaya yol açar ve bu da 0.2’lik bir kısıtlama oranına karşılık gelir. Bu etki, TRIM5 gibi daha klasik kısıtlama faktörlerine kıyasla mütevazı olsa da, etki yine de tekrarlanabilir ve modifiye SAMHD1 ekspresyonlarının, vahşi tip proteine eşdeğer bir şekilde kısıtlayanlara, kısıtlamayanlara ve ara fenotipe sahip olanlara sınıflandırılmasına izin verir.
Bu test, mutant SAMHD1 dizilerini kodlayan virüslerle transdüks ederek SAMHD1 etki alanı ve amino asit mutantlarının kısıtlama fenotiplerini karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan değişimleri bu tahlilde kısıtlanamaz. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Örneğin, HIV-1 ters transkriptaz mutantları SAMHD1 aracılı kısıtlamaya karşı daha hassastır (örneğin, 151V4). Bu protokol, virüs benzeri parçacık (VLP) üretiminin, U937’nin SAMHD1 ekspresyon vektörleri ile transdüksiyonunun, floresan bir muhabir taşıyan HIV enfeksiyonunun ve ardından akış sitometrisi ile yapılan analizin ayrıntılarını özetlemektedir. Bu makalede, hangi verilerin bekleneceği ve optimal olmayan sonuçların nasıl önleneceği anlatılmaktadır. Son olarak, SAMHD1, dNTP seviyeleri ve viral enfeksiyon arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için farklı SAMHD1 varyantlarını incelemenin yanı sıra, tahlil için alternatif kullanımlar özetlenmiştir. SAMHD1’in hücre metabolizmasının merkezindeki rolü göz önüne alındığında, kansere ek bağlantılar ile, bu yoğun bir ilgi alanı olmaya devam etmektedir.
Yukarıdaki notlarda tartışıldığı gibi, protokolün kritik yönleri, VLP üretimi için doğru hücre fenotipini korumak ve SAMHD1 kısıtlamasını gözlemlemek için uygun ortamı yaratmak etrafında toplanmaktadır. İlk olarak, iki renkli akış sitometrisi ile kısıtlamanın doğru analizi, transdüke edilmiş ve enfekte olmuş hücrelerin uygun oranlarının elde edilmesine dayanır, böylece grafiğin her alanında analiz için yeterli hücre bulunur. Bu nedenle, araştırmacı 1’den daha az bir MOI’yi hedeflemelidir (bakınız Protokol). Çok yüksek veya çok düşük olan transdüksiyon ve enfeksiyon oranları, enfekte olmamış veya iki kat enfekte olmuş hücrelerin eksikliği nedeniyle analizde sorunlara yol açmaktadır. Aynı şekilde, karşılaştırılacak SAMHD1 vektörleri için benzer bir transdüksiyon oranı, aynı kompanzasyon matrisinin ve geçidin tüm deneye uygulanmasına izin vermenin anahtarıdır ve sonraki analize olan güveni arttırır.
İkincisi, kullanılan U937 hücrelerinin yaşı, başarılı bir şekilde farklılaşıp farklılaşmamalarında önemli bir faktördür. Başarılı farklılaşma, aderans gözlemi, farklılaşmayı takiben ortamın zaman içinde asitlenmesinin azalması ve tahlilde vahşi tip pozitif kontrol ile yeterli kısıtlama ile izlenebilir. 5 güne kadar farklılaşma başarılı olmuştur.
Bu tahlilin en önemli avantajlarından biri esnekliğidir. SAMHD1’in çeşitli modifiye versiyonları (alanlar, amino asitler, tür dizileri), vektörün veya klonlamanın basit bir saha yönelimli mutagenezi ile test edilebilir. Aynı şekilde, test edici virüsün varyantları da araştırılabilir. Tahlil daha önce dNTP’yi bağlama kapasitesi azaltılmış HIV-1 ters transkriptaz mutantlarının SAMHD1 kısıtlamasına karşı daha duyarlı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Aynı prensip, diğer virüslerin SAMHD1 tarafından kısıtlanmasını test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, değişen farklılaşma koşulları veya hücre içi dNTP konsantrasyonlarının yapay manipülasyonu, hücre içi koşullar ile Bishop laboratuvarında aktif bir araştırma alanı olan SAMHD1 aktivitesi arasındaki etkileşimi daha da araştırmak için kullanılabilir. SAMHD1’in çeşitli nükleozid ters transkriptaz inhibitörleri ile etkileşimi de tanımlanmıştır ve bu tahlil kullanılarak SAMHD1’in etkisi birincil hücrelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiştir12,13,14,15.
Primer hücrelerde kullanılmak üzere protokolün uyarlanması, transforme olmuş hücrelerdeki metabolik fenotiplerin incelenmesiyle ortaya çıkan sınırlamanın üstesinden gelir. Bununla birlikte, mevcut format, özellikle yüksek verimli bir örnekleyiciye sahip bir akış sitometresinin kullanılmasıyla, yüksek verim analizi için uygun ve teknik olarak daha az zorlayıcı bir protokole izin verir. Protokolü uyarlarken, dahili olarak dönüştürülmemiş hücrelerin seyirci etkilerine (örneğin, bağışıklık sinyalizasyonu) duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır.
Hücre biyolojisinin birçok yönüyle olduğu gibi, bu tür testlerin belirli bir fenomeni anlamak için bütünsel bir yaklaşımın parçası olarak kullanılması esastır. SAMHD1 aktivitesi16 için biyokimyasal tahlillerin paralel kullanımı, hücre içi dNTP havuzlarının nicelleştirilmesi ve insanlarda, ex vivo ve hayvan modellerinde SAMHD1 mutant fenotiplerinin gözlemlenmesi (dünyadaki laboratuvarlar tarafından yürütülen, bazıları bu sayıda tanımlanmıştır) bu karmaşık proteinin gelişen anlayışı için anahtardır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, çekirdek finansmanını Cancer Research UK (FC001042 ve FC001162), İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi (FC001042 ve FC001162) ve Wellcome trust’tan (FC001042 ve FC001162) alan Francis Crick Enstitüsü ve JPS’ye Wellcome Trust Araştırmacı Ödülü (108012 / Z / 15 / Z) tarafından desteklenmiştir. Cambridge Üniversitesi’ndeki çalışmalar, NIHR Cambridge Biyomedikal Araştırma Merkezi, Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) ve İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi (MR / S009752/1) tarafından ortaklaşa finanse edildi. İngiltere tarafından finanse edilen ikinci ödül, Avrupa Birliği tarafından desteklenen EDCTP2 programının bir parçasıdır.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |