Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine robuste Plattform für das Expressionsscreening und die Produktion von Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs), die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien verwendet werden sollen. Für die meisten PRMTs und andere Proteine von Interesse, die eine eukaryotische Expressionsplattform benötigen, können Milligrammmengen an Material produziert werden.
Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) Methylat-Arginin-Rückstände auf einer Vielzahl von Proteinen, die in zahlreichen zellulären Prozessen eine Rolle spielen. PRMTs können entweder Mono- oder Dimethylat-Arginin-Guanidino-Gruppen symmetrisch oder asymmetrisch anmuten. Die Enzymologie dieser Proteine ist ein komplexes und intensiv untersuchtes Gebiet, das Milligrammmengen an hochwertigem rekombinantem Protein benötigt. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS), das Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) und Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) Insektenzellen verwendet, wurde für das Expressionsscreening und die Produktion vieler PRMTs, einschließlich PRMT 1, 2 und 4 bis 9, verwendet. Um gleichzeitig nach der Expression mehrerer Konstrukte dieser Proteine zu suchen, einschließlich Domänen und abgeschnittenen Fragmenten sowie der Proteine in voller Länge, haben wir skalierbare Methoden mit einstellbaren und programmierbaren Mehrkanalpipetten in Kombination mit 24- und 96-Well-Platten und -Blöcken angewendet. Insgesamt ermöglichten diese Methodenanpassungen eine groß angelegte Erzeugung von Bacmid-DNA, rekombinanten Viren und Proteinexpressionsscreening. Die Verwendung von Kulturgefäßen mit einem hohen Füllvolumen an Sf9-Zellsuspension trug dazu bei, Platzbeschränkungen in der Produktionspipeline für die Großproteinproduktion in Einzelchargen zu überwinden. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle zur effizienten und kostengünstigen Expression funktioneller PRMTs für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien.
Protein Argininmethyltransferasen (PRMTs) methylat arginin Rückstände in einer Monomethyl- oder symmetrischen/asymmetrischen Dimethyl-Weise. Die sich wiederholenden RG/RGG/GRG-Sequenzen werden von den meisten PRMTs sehr bevorzugt und kommen in einer Vielzahl von Proteinen1,2vor. Argininmethylierte Proteine wie Histone oder Transkriptionsfaktoren und Spleißfaktoren regulieren Transkription, Spleißen und Chromatinstruktur3,4. Das zunehmende Wissen über die vielfältige Regulation der Substrat- und Cofaktorverwertung, des Umsatzes und der Kinetik von PRMTs sowie die Erzeugung selektiver Inhibitoren haben mechanistisches Licht auf diese Enzyme und ihre Komplexe geworfen5,6. Allerdings werden nicht alle PRMT-Familienmitglieder im gleichen Umfang untersucht; Beispielsweise wurde PRMT9 erst kürzlich als Mitglied der PRMT-Familie1entdeckt. Struktur- und Enzymfunktionsstudien für diese Proteine erfordern ausreichende, oft Milligramm, Mengen an rekombinantem Protein, um verfügbar zu sein.
Das prokaryotische Expressionssystem Escherichia coli (E. coli) ist in der Regel die erste Wahl für das Expressionsscreening unter Verwendung mehrerer Konstrukte für ein bestimmtes Protein7,8,9. Die E. coli-basierteExpression führt jedoch nicht immer zu ausreichenden Mengen an PRMT-Proteinen in ihren aktiven Formen, wie wir insbesondere für PRMT5 und PRMT7 festgestellt haben (siehe unten). So wurden PRMTs, die sich nicht in E. coli exprimierten oder von der eukaryotischen Expressionsmaschinerie produziert werden mussten, in Vektoren subkloniert, die für das Expressionsscreening im alternativen Baculovirus-Expressionsvektorsystem (BEVS) geeignet waren. Während E. coli-exprimierte Proben von PRMT1, PRMT3 und PRMT8 ausgiebig für In-vitro-Assays und Kristallographie verwendet wurden, erfordern andere PRMTs wie PRMT5, das einen MEP50-Bindungspartner seiner dualen Methyltransferase-Domäne erfordert, und PRMTs wie PRMT7 und 9 die Expression von Insektenzellen, um ausreichende Mengen an aktivem Protein zu erhalten. Insgesamt haben die standardisierten Mitteldurchsatz-Methyltransferase-Assays für PRMT4, 5, 6, 7 und 9 den BEVS in Insektenzellen6verwendet. Das Baculovirus Expression Vector System (BEVS) ist eine vielseitige Plattform zur Herstellung rekombinanter Proteine, die die eukaryotische Expressionsmaschinerie erfordern, die post translationale Modifikationen ermöglicht, die für biochemische, biophysikalische und strukturelle Studien unerlässlich sind10,11,12. Mehrere BEVS sind seit der ersten berichteten Verwendung von Baculoviren im Jahr 1983 zur Proteinexpression kommerziell verfügbar geworden13. Die meisten dieser Protokolle verwenden unterschiedliche Strategien für die Übertragung des Expressionsplasmids in Insektenzellen. Dazu gehören Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK usw. Unser Protokoll basiert auf dem am häufigsten verwendeten System in BEVS, dem Bac-to-Bac-System14, das entwickelt wurde, um das Gen / cDNA, das für das interessierende Protein (POI, hier die PRMTs) kodiert, in das Baculovirus-Genom zu übertragen, das in einem spezialisierten Stamm von E. coli über eine ortsspezifische Transposition15aufrechterhalten wird.
Kurz gesagt, der Plasmidtransfervektor, der das interessierende Gen enthält, wurde in DH10Bac E. coli-kompetente Zellen umgewandelt, um rekombinante virale Bacmid-DNA zu erzeugen. Adhärente Sf9-Zellen wurden dann mit Bacmid-DNA transfiziert. Vier bis fünf Tage nach der Transfektion wurden die ersten rekombinanten Baculoviren, die in das Zellkulturmedium sezerniert wurden, wiederhergestellt und als P1-Virus markiert. Die P1-Baculovirus-Bestände wurden dann für die Virusamplifikation (d. h. die Erzeugung von P2-Baculovirus-Beständen) und das Proteinexpressionsscreening verwendet. Basierend auf den Expressionsscreening-Ergebnissen wurden P2-Viren für das beste Expressionskonstrukt des Proteins identifiziert und verwendet, um Suspensionskulturen von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIS) für die groß angelegte Proteinproduktion zu erzeugen. Hier beschreiben wir unsere detaillierten Protokolle und beschreiben die Gründe für unsere Reagenz- und Kulturgefäßentscheidungen, um unsere Strategie zu unterstützen, eine zeiteffizientere, kostengünstigere und skalierbarere Methodik zu entwickeln, um ausreichende Mengen an gewünschten rekombinanten Proteinen zu erhalten.
Einer der Vorteile von BEVS in Insektenzellen enthält die Fähigkeit der post-translationalen Modifikationsmaschinerie, komplexere Modifikationen wie Phosphorylierung, Myristoylierung und Glykosylierung zu ermöglichen. Zusammen mit der hocheffizienten Faltung von Säugetierproteinen ermöglichen diese Modifikationen hohe Mengen an modifiziertem und gefaltetem Protein, das für physiologisch relevante nachgeschaltete Experimente geeignetist 16.
Hier beschrieben wir detaillierte Protokolle des BEVS, die kritische Elemente für ein erfolgreiches Expressionsscreening mehrerer Konstrukte von PRMT-Proteinen und die großräumige PRMT-Proteinproduktion in der Baculovirus-Expressionsplattform hervorheben: 1) Die Verwendung regelmäßiger, einstellbarer und programmierbarer Mehrkanalpipetten, um die biologischen Materialien zwischen 24- und 96 -well-Zellkulturplatten und -blöcken in den Stadien der Bacmid-DNA- und Virusgenerierung zu übertragen; eine Sammlung der rekombinanten Viren, Amplifikation der Virusvolumina der rekombinanten Viren und Herstellung der Proteinexpressions-Screening-Blöcke. 2) Leistungsstarke und kostengünstige Transfektionsreagenzien zur Erzeugung rekombinanter Viren. 3) Suspensionskultur von Baculovirus-infizierten Insektenzellen (SCBIIC) für die proteinbasierte Produktion in großem Maßstab. 4) Verwendung von 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben mit hohem Füllvolumen zur Aufrechterhaltung der Sf9-Suspensionskultur und 2,5-L-Tunair-Schüttelkolben und 5-L-Reagenzflaschen für die proteingroße Proteinproduktion.
Besondere Überlegungen und Begründungen für die Transformations- und Transfektionsschritte.
Obwohl ein kommerzielles Protokoll die Verwendung von 100 μL kompetenter Zellen für eine Transformation14empfiehlt, beträgt die Umwandlungseffizienz kommerzieller DH10Bac E. coli-kompetenter Zellen so hoch wie 1 x10 8 KBE / μg DNA, so dass wir nur 4 μL verwenden. Dies reicht für jedes Transformant aus, um isolierte weiße rekombinante Kolonien für die Bacmid-DNA-Isolierung zu erhalten. Adhärente Sf9-Zellen in der 24-Well-Transfektionsplatte wurden mit einer Zelldichte von 2 x 105 /ml in 0,5 ml serumfreier Insektenmedien ausgesät. Dieses Volumen reicht aus, um eine gleichmäßige Abdeckung der Arbeitsfläche des Brunnens zu gewährleisten. Gleichzeitig verdünnt es die Transfektionsmischung nicht zu sehr, was die Transfektionseffizienz erhöht. Transfektionsreagenzien sind für die Sf9-Zellen ungiftig, und ein Medienaustausch ist nicht erforderlich. Anstelle eines Medienwechsels werden zusätzliche 1,5 ml Medien mit 10% (v / v) FBS 4-5 Stunden nach der Transfektionszeit in die Transfektionsplatte eingelegt, um das Zellwachstum zu erleichtern. Die Transfektionseffizienz beider Transfektionsreagenzien ist hoch. Dennoch treten bei X-tremeGene 9 die Anzeichen einer Infektion in den transfizierten Zellen (Abbildung 2) 10-12 h früher auf als mit dem JetPrime-Reagenz, so dass wir zwischen diesen Reagenzien wählen, abhängig vom Arbeitsplan der nächsten Schritte in den Protokollen, was eine gewisse Flexibilität im Gesamtprozess bietet.
Das Proteintestexpressionsscreening kann mit P2-Viren eingerichtet werden, wenn die Menge der anfänglichen rekombinanten Viren, die von der Transfektionsplatte gesammelt und als P1 gekennzeichnet sind, ein limitierender Faktor für das Proteinexpressionsscreening ist.
Überlegungen beim Wechsel von kleinen zu großen Kulturvolumen.
Historisch gesehen glaubte man, dass ein optimales Zellwachstum einen hohen Luftraum in der Suspensionskultur der Sf9-Zellwartung und Scale-up-Produktion erfordert. Im Jahr 2014 wurde jedoch berichtet, dass ein hoher Luftraum in Kulturschiffen weniger kritisch ist als bisher angenommen17. Ein Kulturgefäß, das mit einer entsprechend an den Orbitalwurf der Schüttelplattform angepassten Schüttelgeschwindigkeit eingerichtet ist, sorgt auch in der Suspensionskultur mit hohem Füllvolumen für einen ausreichenden Sauerstofftransfer, indem kleine Luftblasen für eine längere Zeit erzeugt und aufrechterhalten werden. Mit diesem Ansatz können kommerziell erhältliche Insektenzellen mit einer höheren Schüttelgeschwindigkeit innerhalb eines normalen Bereichs der Verdopplungszeit der Zellen kultiviert werden, ohne die hohe Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen.
So haben wir vor 6 Jahren begonnen, das Suspensionskulturvolumen in einem Schüttelkolben während der Zellwartung zu erhöhen und eine andere Art von Kulturgefäß für die Proteinproduktion einzuführen, während wir die Schüttelbedingungen anpassen und überwachen (Abbildung 6). Um optimale Bedingungen in diesen Kulturgefäßen zu schaffen, überwachten wir die Sf9-Zellkulturparameter wie die Zellverdopplungszeit zusammen mit der Zelllebensfähigkeit, Größe und Form, dem Aggregationszustand und der Infektabilität der Zellen.
Zum Beispiel kulturieren wir für die Sf9-Zellerhaltung in den 2,8-L-Fernbach-Schüttelkolben 2 L anstelle von 0,8 L der Sf9-Suspensionszellen, die bei 150 U / min bei 27 ° C schütteln, und die Zelllebensfähigkeit liegt die meiste Zeit bei fast 99%, mit gleichmäßig geformten gesunden Teilungszellen. Für die Scale-up-Produktion infizieren wir 4 L Zellen in 5-L-Reagenzflaschen, die mit hoher Geschwindigkeit als 145 U / min bei einer niedrigeren Temperatur von 25 ° C schütteln. Die am häufigsten verwendeten Inkubatoren mit eingebauter Schüttelplattform können 6 x 2,8 L Schüttelkolben oder 6 x 5 L Reagenzflaschen oder 10 x 2,5 L Tunair Schüttelkolben aufnehmen. So beträgt die Kapazität der einen Schüttelplattform, wenn wir Fernbach-Schüttelkolben und Reagenzflaschen auf 1/3 gegenüber dem hohen Füllvolumen der Gefäße füllen, 4,8 L gegenüber 12 L mit 2,8 L Fernbach-Schüttelkolben und 10 L gegenüber 24 L mit 5 L Reagenzflaschen(Abbildung 6). Die Wartung der Suspensionszellkultur und die Scale-up-Produktion in den Kulturgefäßen mit hohem Füllvolumen haben uns geholfen, die Einschränkungen der Produktionsmengen zu überwinden und eine groß angelegte Plattform einzuführen. Daher ist dies sehr nützlich für Labore ohne Zugang zu Bioreaktoren und / oder begrenztem Platz in den Produktionspipelines.
Dieses Protokoll könnte leicht für die Herstellung und Aufreinigung von Proteinkonstrukten mit unterschiedlichen Affinitäts-Tags angepasst werden, indem geeignete Harze verwendet und Reinigungspuffer modifizieren werden, wie in der von SGC veröffentlichten Arbeit6 für die Flag-markierten Full-Length-Proteine von PRMT4, 7, 9 und den His-tagged PRMT5-MEP50-Komplex und PRMT6 beschrieben wurde. Obwohl wir ein BEVS-Protokoll für die PRMT-Proteinfamilie beschreiben, kann der gleiche Ansatz auf jede andere Proteinfamilie angewendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Dalia Barsyte-Lovejoy dafür, dass sie sich die Zeit genommen haben, wertvolles Feedback und kritische Kommentare zum Manuskript zu geben, und allen unseren SGC-Kollegen, die mit der PRMT-Proteinfamilie aus dem Baculovirus Expression Vector System gearbeitet haben.
Die SGC ist eine eingetragene Wohltätigkeitsorganisation (Nummer 1097737), die Mittel von AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada über das Ontario Genomics Institute [OGI-196], die EU und EFPIA über das Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN-Zuschuss 875510], Janssen, Merck KGaA (auch bekannt als EMD in Kanada und den USA), Pfizer, Takeda und den Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z] erhält.
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |