Baculovirusudtryksvektorsystemet (BEVS) er en robust platform for ekspressionsscreening og produktion af proteinalgininmethyletransferaser (PRMT’er), der skal anvendes til biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser. Milligram mængder materiale kan produceres for de fleste PRMT’er og andre proteiner af interesse, der kræver en eukaryote udtryksplatform.
Protein arginin methyltransferaser (PRMTs) methylat argininrester på en bred vifte af proteiner, der spiller roller i mange cellulære processer. PRMT’er kan enten mono- eller dimethylat arginin guanidinogrupper symmetrisk eller asymmetrisk. Enzymologien af disse proteiner er et komplekst og intenst undersøgt område, der kræver milligrammængder af rekombinant protein af høj kvalitet. Baculovirus-ekspressionsvektorsystemet (BEVS), der anvender autografa californica multipel nukleopolyhedrovirus (AcMNPV) og Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektceller, er blevet brugt til ekspressionsscreening og produktion af mange PRMT’er, herunder PRMT 1, 2 og 4 til 9. For samtidig at screene for ekspressionen af flere konstruktioner af disse proteiner, herunder domæner og afkortede fragmenter samt proteiner i fuld længde, har vi anvendt skalerbare metoder ved hjælp af justerbare og programmerbare multikanalpipetter kombineret med 24- og 96-brønds plader og blokke. Samlet set muliggjorde disse metodejusteringer en storstilet generation af bacmid-DNA, rekombinant virus og proteinudtryksscreening. Brug af kulturskibe med et stort fyldvolumen af Sf9-celleaffjedring bidrog til at overvinde pladsbegrænsninger i produktionspipelinen til enkeltbatchproteinproduktion i stor skala. Her beskriver vi detaljerede protokoller for et effektivt og omkostningseffektivt udtryk for funktionelle PRMT’er til biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser.
Proteinalgininmethyletransferaser (PRMT’ er) methylatalgininrester på en monomethyl- eller symmetrisk/asymmetrisk dimethylemode. De gentagne RG/RGG/GRG-sekvenser foretrækkes i høj grad af de fleste PRMT’er og findes i en lang række proteiner1,2. Arginin methylerede proteiner såsom histoner eller transskriptionsfaktorer og splejsningsfaktorer regulerer transskription, splejsning og kromatinstruktur3,4. Øget viden om forskellige regulering af substrat og cofaktor udnyttelse, omsætning, og kinetik af PRMTs, samt generering af selektive hæmmere, har kastet mekanistisk lys over disse enzymer og deres komplekser5,6. Det er dog ikke alle PRMT-familiemedlemmer, der studeres i samme omfang; prmt9 blev først for nylig opdaget at være medlem af PRMT-familien1. Struktur- og enzymfunktionsundersøgelser for disse proteiner kræver tilstrækkelige, ofte milligram, mængder rekombinant protein til rådighed.
Det prokaryote udtrykssystem Escherichia coli (E. coli) er normalt det første valg til ekspressionsscreening ved hjælp af flere konstruktioner for et givet protein7,8,9. E. coli-baseretudtryk resulterer imidlertid ikke altid i tilstrækkelige mængder PRMT-proteiner i deres aktive former, som vi især har bemærket for PRMT5 og PRMT7 (se nedenfor). Prmts, der ikke kunne udtrykke sig i E. coli eller skulle fremstilles af den eukaryote udtryksmaskine, blev således omstænket til vektorer, der var egnede til ekspressionscreening i det alternative baculovirusudtrykvektorsystem (BEVS). Mens E. coli udtrykte prøver af PRMT1, PRMT3 og PRMT8 er blevet anvendt i vid udstrækning til in vitro-assays og krystallografi, kræver andre PRMT’er som PRMT5, som kræver MEP50-bindende partner for sit dobbelte methyltransferasedomæne og PRMT’er som PRMT7 og 9, insektcelleudtryk for at opnå tilstrækkelige mængder aktivt protein. Samlet set har de standardiserede medium-throughput methyltransferase assays for PRMT4, 5, 6, 7 og 9 udnyttet BEVS i insektceller6. Baculovirus-ekspressionens vektorsystem (BEVS) er en alsidig platform til fremstilling af rekombinante proteiner, der kræver den eukaryote ekspressionsmaskine, der muliggør postoversættelsesændringer, der er afgørende for biokemiske, biofysiske og strukturelle undersøgelser10,11,12. Flere BEVS’er er blevet kommercielt tilgængelige siden den første rapporterede brug af baculovirus i 1983 til proteinudtryk13. De fleste af disse protokoller anvender forskellige strategier for overførsel af udtrykket plasmid i insektceller. Disse omfatter Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK osv. Vores protokol er baseret på det mest anvendte system i BEVS, Bac-to-Bac system14, som er designet til at overføre genet / cDNA kodning af protein af interesse (POI, her PRMTs) i baculovirus genom opretholdes i en specialiseret stamme af E. coli via site-specifikke gennemførelse15.
Kort, plasmid overførsel vektor, der indeholder genet af interesse blev omdannet til DH10Bac E. coli kompetente celler til at generere rekombinant viral bacmid DNA. Klæbende Sf9 celler blev derefter transfected med bacmid DNA. Fire til fem dage efter transfekten blev de første rekombinante baculovirus, der blev udskillet i cellekulturmediet, genvundet og mærket som P1-virus. P1-baculoviruslagrene blev derefter anvendt til virusforstærkning (dvs. generering af P2-baculoviruslagre) og screening af proteinudtryk. Baseret på resultaterne af ekspressionen blev P2-vira til det bedste udtrykskonstruktion af proteinet identificeret og brugt til at generere suspensionskulturer af baculovirusinficerede insektceller (SCBIIS) til den store proteinproduktion. Her beskriver vi vores detaljerede protokoller og beskriver rationalet bag vores valg af reagens- og kulturbeholder for at understøtte vores strategi om at udvikle en mere tidseffektiv, omkostningseffektiv og skalerbar metode til at opnå tilstrækkelige mængder ønskede rekombinante proteiner.
En af fordelene ved BEVS i insektceller er centreret om evnen til den post-translationelle modifikation maskiner til at muliggøre mere komplekse ændringer såsom fosforylering, myristoylering, og glykosylering. Sammen med den meget effektive foldning af pattedyrproteiner letter disse modifikationer store mængder modificeret og foldet protein, der er egnet til fysiologisk relevante downstream-forsøg16.
Her beskrev vi detaljerede protokoller for BEVS, der understreger kritiske elementer til vellykket ekspressionsscreening af flere konstruktioner af PRMT-proteiner og storstilet PRMT-proteinproduktion i Baculovirus-udtryksplatformen: 1) Brugen af regelmæssige, justerbare og programmerbare multikanalpipetter til at overføre de biologiske materialer mellem 24- og 96 – brøndcellekulturplader og blokke på stadierne af bacmid DNA og virusgenerering; en samling af rekombinant virus, forstærkning af virale mængder af rekombinant virus og forberedelse af proteinudtryksscreeningsblokkene. 2) Højtydende og omkostningseffektivt transfekt reagenser til fremstilling af rekombinante vira. 3) Suspensionskultur af baculovirusinficerede insektceller (SCBIIC) til storstilet proteinproduktion. 4) Udnyttelse af højfyldningsvolumen 2,8 L Fernbach-rystekolber til opretholdelse af Sf9-affjedringskultur og 2,5 L Tunair-rystekolber og 5 L reagensflasker til storproteinproduktion.
Særlige overvejelser og begrundelser for transformations- og transinfektionstrinnene.
Selv om en kommerciel protokol anbefaler at anvende 100 μL kompetente celler til en transformation14, er transformationseffektiviteten af kommercielle DH10Bac E. coli-kompetente celler helt oppe på 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi bruger kun 4 μL. Dette er nok for hver transformant til at opnå isolerede hvide rekombinant kolonier for bacmid DNA isolation. Klæbende Sf9-celler i 24-brønds transfektpladen blev seedet ved en celletæthed på 2 x 105 / mL i 0,5 mL Serum-Free Insect Media. Dette volumen er nok til at sikre jævn dækning af brøndens arbejdsflade. Samtidig fortynder det ikke transfektblandingen for meget, hvilket øger transfekteffektiviteten. Transfektreagenser er ikke-giftige for Sf9-cellerne, og medieudveksling er ikke nødvendig. I stedet for en medieændring tilføjes yderligere 1,5 mL medier, der indeholder 10% (v/v) FBS, i transfekturepladen ved 4-5 timers post-transinfektionstid for at lette cellevæksten. Transfekteffektiviteten af begge transfektreagenser er høj. Stadig, med X-tremeGene 9, vises tegn på infektion i de transfected celler (Figur 2) 10-12 timer tidligere end med JetPrime reagens, så vi vælger mellem disse reagenser afhængigt af arbejdsplanen for de næste trin i protokollerne, hvilket giver en vis fleksibilitet i den samlede proces.
Screening af proteintestudtryk kan sættes op med P2-vira, hvis mængden af de oprindelige rekombinante vira, der er indsamlet fra transfekturepladen og mærket som P1, er en begrænsende faktor, der skal anvendes til proteinudtryksscreeningen.
Overvejelser, når du flytter fra små til store kulturmængder.
Historisk set blev det antaget, at optimal cellevækst kræver et højt luftrum i suspensionskulturen af Sf9-cellevedligeholdelse og opskaleringsproduktioner. I 2014 blev det imidlertid rapporteret, at højt luftrum i kulturfartøjer er mindre kritisk end tidligere antaget17. En kulturbeholder, der er oprettet ved hjælp af passende justeret rystehastighed til rysteplatformens kredsløbskast, vil give tilstrækkelig iltoverførsel selv i højfyldningsvolumenaffjedringskulturen ved at skabe og opretholde små luftbobler i længere tid. Med denne tilgang kan kommercielt tilgængelige insektceller dyrkes ved en højere rystehastighed inden for et normalt område af cellernes fordoblingstid uden at ofre høj celle levedygtighed.
For 6 år siden begyndte vi således at øge suspensionskulturvolumenet i en rystekolbe under cellevedligeholdelse og introducerede en anden type dyrkningsbeholder til proteinproduktion, mens vi justerede og overvågede rysteforholdene (Figur 6). For at etablere optimale forhold i disse kulturkar overvågede vi Sf9-cellekulturparametrene såsom cellesplitningstid sammen med celle levedygtighed, størrelse og form, aggregeringstilstand og infektiøsitet af celler.
For eksempel, for Sf9 celle vedligeholdelse, i 2,8 L Fernbach ryste kolber, vi kultur 2 L i stedet for 0,8 L af Sf9 suspension celler ryster ved 150 omdrejninger ved 27 °C og celle levedygtighed det meste af tiden er tæt på 99%, med jævnt formede sunde dividere celler. Til opskaleringsproduktion inficerer vi 4 L celler i 5 L reagensflasker, der ryster ved høj hastighed som 145 omdrejninger i minuttet ved en sænket temperatur på 25 °C. De mest almindeligt anvendte inkubatorer med indbygget rysteplatform kan rumme 6 x 2,8 L shakekolber eller 6 x 5 L reagensflasker eller 10 x 2,5 L Tunair-shakekolber. Således er kapaciteten på den ene rysteplatform, hvis vi fylder Fernbach shakeflasker og reagensflasker til 1/3 i forhold til beholdernes store påfyldningsvolumen, 4,8 L mod 12 L ved hjælp af 2,8 L Fernbach-rystekolber og 10 L mod 24 L ved hjælp af 5 L reagensflasker (Figur 6). Suspension cellekultur vedligeholdelse og opskalering produktion i kulturen fartøjer med en høj-fyld volumen har hjulpet os med at overvinde begrænsninger i produktionen mængder og vedtage en storstilet platform. Dette er således meget nyttigt for laboratorier uden adgang til bioreaktorer og / eller begrænset plads i produktionspipelinerne.
Denne protokol kunne let tilpasses til produktion og rensning af proteinkonstruktioner med forskellige affinitetsmærker ved at anvende passende harpikser og ændre rensningsbuffere, som det er beskrevet i SGC offentliggjort papir6 for de flagmærkede proteiner i fuld længde af PRMT4, 7, 9 og Hans-mærkede PRMT5-MEP50-kompleks og PRMT6. Selvom vi beskriver en BEVS-protokol for PRMT-familien af proteiner, kan den samme tilgang anvendes på enhver anden proteinfamilie.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dalia Barsyte-Lovejoy for at have taget sig tid til at give værdifuld feedback og kritiske kommentarer til manuskriptet og alle vores SGC-kolleger, der arbejdede med PRMT-proteinfamilien udtrykt fra Baculovirus Expression Vector System.
SGC er en registreret velgørenhedsorganisation (nummer 1097737), der modtager midler fra AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada gennem Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU og EFPIA gennem Joint Undertaking 2 (EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (alias EMD i Canada og USA), Pfizer, Takeda og Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |