बैकुलोवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर सिस्टम (बीईवीएस) बायोकेमिकल, बायोफिजिकल और स्ट्रक्चरल स्टडीज के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और उत्पादन के लिए एक मजबूत मंच है। सामग्री की मिलीग्राम मात्रा पीआरएमटी के बहुमत और रुचि के अन्य प्रोटीन के लिए उत्पादित की जा सकती है जिसमें यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मंच की आवश्यकता होती है।
प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) मेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों पर विभिन्न प्रकार के प्रोटीन हैं जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका निभाते हैं। पीआरएमटीएस या तो मोनो-या डाइमेथिलेट आर्जिनिन ग्वानिडिनो समूह सममित या विषम रूप से कर सकते हैं। इन प्रोटीनों की एंजाइमोलॉजी एक जटिल और तीव्रता से जांच किया गया क्षेत्र है जिसके लिए उच्च गुणवत्ता वाले पुनर्संयोजन प्रोटीन की मिलीग्राम मात्रा की आवश्यकता होती है। बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (बीईवीएस) ऑटोग्राफा कैलिफोर्निका मल्टीपल न्यूक्लियोपोलिहेड्रोवायरस (एसीएमएनपीवी) और स्पोडोप्टेरा मितव्ययीपेंडा 9 (एसएफ9) कीट कोशिकाओं का उपयोग पीआरएमटी 1, 2 और 4 से 9 सहित कई पीआरएमटी की अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग और उत्पादन के लिए किया गया है। इन प्रोटीनों के कई निर्माणों की अभिव्यक्ति के लिए एक साथ स्क्रीन करने के लिए, डोमेन और कटे हुए टुकड़ों के साथ-साथ पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन सहित, हमने समायोज्य और प्रोग्रामेबल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हुए स्केलेबल तरीकों को लागू किया है, जो 24-और 96-अच्छी प्लेटों और ब्लॉकों के साथ संयुक्त है। कुल मिलाकर, इन विधि समायोजनों ने बड़े पैमाने पर बैकमिड डीएनए, पुनः संयोजन वायरस और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग की पीढ़ी को सक्षम किया। Sf9 सेल निलंबन की एक उच्च भरने की मात्रा के साथ संस्कृति जहाजों का उपयोग करने के लिए एक बैच बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए उत्पादन पाइपलाइन में अंतरिक्ष सीमाओं को दूर करने में मदद की । यहां, हम जैव रासायनिक, जैव भौतिक और संरचनात्मक अध्ययनों के लिए कार्यात्मक पीआरएमटी की कुशल और लागत प्रभावी अभिव्यक्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
प्रोटीन आर्जिनिन मिथाइलट्रांसफेरेसेस (पीआरएमटीएस) मेथिलेट आर्जिनिन अवशेषों को मोनोमिथाइल या सममित/असममित डिमेथाइल फैशन में । दोहराव आरजी/आरजीजी/जीआरजी दृश्यों को अधिकांश पीआरएमटीएस द्वारा अत्यधिक पसंद किया जाता है और इसमें विभिन्न प्रकार के प्रोटीन पाए जाते हैं1,2. आर्जिनिन मिथाइलेटेड प्रोटीन जैसे हिटोन या ट्रांसक्रिप्शन कारक और स्प्लिसिंग कारक ट्रांसक्रिप्शन, स्प्लिसिंग और क्रोमेटिन संरचना3,4को विनियमित करते हैं। पीआरएमटीएस के सब्सट्रेट और कोफैक्टर उपयोग, टर्नओवर और काइनेटिक्स के विविध नियमन के बढ़ते ज्ञान के साथ-साथ चयनात्मक अवरोधकों की पीढ़ी ने इन एंजाइमों और उनके परिसरों5,6पर मशीनी प्रकाश डाला है। हालांकि, सभी पीआरएमटी परिवार के सदस्यों का एक ही हद तक अध्ययन नहीं किया जाता है; उदाहरण के लिए, PRMT9 केवल हाल ही में PRMT परिवार1के एक सदस्य होने की खोज की थी । इन प्रोटीनों के लिए संरचना और एंजाइम कार्य अध्ययन के लिए पर्याप्त, अक्सर मिलीग्राम, पुनर्संयोजन प्रोटीन की मात्रा उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है।
एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई)प्रोकैरियोटिक अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए पहली पसंद है जिसमें दिए गए प्रोटीन 7,8, 9 के लिए कई संरचनाओं का उपयोग कियाजाताहै । हालांकि, ई. कोलाई-आधारितअभिव्यक्ति हमेशा उनके सक्रिय रूपों में पीआरएमटी प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा में परिणाम नहीं देती है, जैसा कि हमने विशेष रूप से PRMT5 और PRMT7 के लिए उल्लेख किया है (नीचे देखें)। इस प्रकार, पीआरएमटी जो ई. कोलाई में व्यक्त करने में विफल रहे हैं या यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मशीनरी द्वारा उत्पादित किए जाने की आवश्यकता है, वैकल्पिक बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम (बीईवीएस) में अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त वैक्टर में उप-संरक्षित थे। जबकि ई कोलाई ने पीआरएमटी 1, पीआरएमटी 3 और पीआरएमटी8 के नमूनों को इन विट्रो परख और क्रिस्टलोग्राफी के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, पीआरएमटी 5 जैसे अन्य पीआरएमटी, जिसके लिए अपने दोहरे मिथाइलट्रांसफरेज डोमेन के एमईपी 50 बाध्यकारी साथी की आवश्यकता होती है, और पीआरएमटी7 और 9 जैसे पीआरएमटी, सक्रिय प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए कीट कोशिका अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। कुल मिलाकर, PRMT4, 5, 6, 7 और 9 के लिए मानकीकृत मध्यम-थ्रूपुट मिथाइलट्रांसफरेज परख ने कीट कोशिकाओं6में बीईवीएस का उपयोग किया है। बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (बीईवीएस) यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति मशीनरी की आवश्यकता वाले पुनर्संयोजन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक बहुमुखी मंच है जो जैव रासायनिक, जैव भौतिकीय और संरचनात्मक अध्ययन10, 11, 12के लिए आवश्यक अनुवादात्मक संशोधनों को सक्षम बनाता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति13के लिए 1983 में बाकुलोवायरस के पहले उपयोग की सूचना के बाद से कई बीईवीएस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं । इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड को कीट कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को नियोजित करते हैं। इनमें बीएसी-टू-बीएसी, फ्लैशबैक, बाकुलोगोल्ड ब्राइट, बैकवेक्टर-3000, बैकमैजिक, बैकपाक आदि शामिल हैं। हमारा प्रोटोकॉल बीईवीएस में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली प्रणाली पर आधारित है, बीएसी-टू-बीएसी सिस्टम14,जिसे जीन/सीडीएनए को ब्याज के प्रोटीन (पीओआई, यहां पीआरएमटीएस) को साइट-विशिष्ट पक्षांतरण15के माध्यम से ई कोलाई के एक विशेष तनाव में बनाए रखा गया है।
संक्षेप में, ब्याज के जीन युक्त प्लाज्मिड ट्रांसफर वेक्टर को पुनः संयोजन वायरल बैकमिड डीएनए उत्पन्न करने के लिए DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदल दिया गया था। इसके बाद अनुयायी एसएफ 9 कोशिकाओं को बैकमिड डीएनए से संक्रमित किया गया । ट्रांसफेक्शन के चार से पांच दिन बाद, सेल कल्चर मीडियम में स्रावित प्रारंभिक रिकॉम्बिनेंट बाकुलोवायरस बरामद किए गए और उन्हें पी1 वायरस के रूप में लेबल किया गया । P1 baculovirus स्टॉक्स तो वायरस प्रवर्धन (यानी, P2 baculovirus शेयरों की पीढ़ी) और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया । अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग परिणामों के आधार पर, प्रोटीन के सर्वोत्तम अभिव्यक्ति निर्माण के लिए पी 2 वायरस की पहचान की गई और बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (एससीबीआईआईएस) की निलंबन संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया। यहां, हम अपने विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और वांछित पुनर्संयोजन प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए अधिक समय-कुशल, लागत कुशल और स्केलेबल पद्धति विकसित करने की हमारी रणनीति का समर्थन करने के लिए हमारे अभिकर्षक और संस्कृति पोत विकल्पों के पीछे के औचित्य का वर्णन करते हैं।
कीट कोशिकाओं में बीईवीएस के फायदों में से एक पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन मशीनरी की क्षमता पर केंद्र होता है ताकि फॉस्फोरिलेशन, माय्रिस्टोइलेशन और ग्लाइकोसिलेशन जैसे अधिक जटिल संशोधनों को सक्षम किया जा सके। स्तनधारी प्रोटीन के अत्यधिक कुशल तह के साथ, ये संशोधन शारीरिक रूप से प्रासंगिक डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उपयुक्त संशोधित और मुड़ा हुआ प्रोटीन की उच्च मात्रा की सुविधा प्रदान करते हैं16।
यहां, हमने बीईवीएस के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसमें पीआरएमटी प्रोटीन के कई निर्माणों की सफल अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण तत्वों पर जोर दिया गया है और बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति मंच में बड़े पैमाने पर पीआरएमटी प्रोटीन उत्पादन: 1) 24 और 96-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों और बैचमिड डीएनए वायरस के चरणों में जैविक सामग्रियों को स्थानांतरित करने के लिए नियमित, समायोज्य और प्रोग्रामेबल मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग रिकॉम्बिनेंट वायरस का संग्रह, रिकॉम्बिनेंट वायरस के वायरल वॉल्यूम का प्रवर्धन और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग ब्लॉक की तैयारी। 2) रिकॉम्बिनेंट वायरस की पीढ़ी के लिए उच्च प्रदर्शन और लागत प्रभावी ट्रांसफैक्शन रिएजेंट। 3) बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए बाकुलोवायरस-संक्रमित कीट कोशिकाओं (एससीबीआईआईसी) की निलंबन संस्कृति। 4) बड़े पैमाने पर प्रोटीन उत्पादन के लिए Sf9 निलंबन संस्कृति और 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क और 5 एल रिएजेंट बोतलों को बनाए रखने के लिए उच्च-भर मात्रा 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क का उपयोग।
परिवर्तन और परिवर्तन के लिए विशेष विचार और तर्क कदम।
यद्यपि एक वाणिज्यिक प्रोटोकॉल एक परिवर्तन 14 के लिए सक्षम कोशिकाओं के100माइक्रोन का उपयोग करने की सिफारिश करता है, वाणिज्यिक DH10Bac ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं की परिवर्तन दक्षता 1 x 108 cfu/μg डीएनए के रूप में उच्च है, इसलिए हम केवल 4 माइक्रोन का उपयोग करते हैं। यह प्रत्येक ट्रांसफॉर्मेंट के लिए बैकमिड डीएनए अलगाव के लिए अलग-थलग सफेद पुनर्संयोजन उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। 24-वेल ट्रांसफैक्शन प्लेट में अनुयायी एसएफ9 कोशिकाओं को सीरम-फ्री कीट मीडिया के 0.5 एमएल में 2 x10 5 /एमएल के सेल घनत्व पर वरीयता दी गई थी। यह मात्रा अच्छी तरह से काम करने की सतह के कवरेज को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है। साथ ही, यह ट्रांसफैक्शन मिश्रण को बहुत अधिक कमजोर नहीं करता है, जो ट्रांसफैक्शन दक्षता को बढ़ाता है। ट्रांसफैक्शन रीएजेंट्स एसएफ9 कोशिकाओं के लिए गैर-विषाक्त हैं, और मीडिया एक्सचेंज आवश्यक नहीं है। मीडिया परिवर्तन के बजाय, सेल विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए 10% (v/v) एफबीएस युक्त मीडिया का एक अतिरिक्त 1.5 एमएल ट्रांसफैक्शन प्लेट में 4-5 घंटे बाद ट्रांसफैक्शन समय में जोड़ा जाता है। दोनों ट्रांसफेक्शन रीएजेंट्स की ट्रांसफेक्शन एफिशिएंसी ज्यादा है। फिर भी, एक्स-ट्रेमेजीन 9 के साथ, संक्रमित कोशिकाओं(चित्रा 2)में संक्रमण के लक्षण जेटप्राइम रिएजेंट की तुलना में 10-12 घंटे पहले दिखाई देते हैं, इसलिए हम प्रोटोकॉल में अगले चरणों के कार्य कार्यक्रम के आधार पर इन अभिकर्मकों के बीच चयन करते हैं, जो समग्र प्रक्रिया में कुछ लचीलापन प्रदान करता है।
प्रोटीन टेस्ट अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग P2 वायरस के साथ स्थापित किया जा सकता है अगर प्रारंभिक recombinant वायरस की मात्रा, ट्रांसफैक्शन प्लेट से एकत्र और P1 के रूप में लेबल, प्रोटीन अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक सीमित कारक है ।
छोटे से बड़ी संस्कृति की मात्रा में जाने पर विचार।
ऐतिहासिक रूप से, यह माना जाता था कि इष्टतम सेल विकास को एसएफ 9 सेल रखरखाव और स्केल-अप प्रस्तुतियों की निलंबन संस्कृति में एक उच्च वायु स्थान की आवश्यकता होती है। हालांकि, 2014 में, यह बताया गया था कि संस्कृति जहाजों में उच्च वायु क्षेत्र पहले से17सोचा की तुलना में कम महत्वपूर्ण है। एक संस्कृति पोत मिलाते हुए मंच के कक्षीय फेंक करने के लिए उचित समायोजित मिलाते हुए गति का उपयोग कर स्थापित एक लंबे समय के लिए छोटे हवा बुलबुले बनाने और बनाए रखने के द्वारा उच्च भरने मात्रा निलंबन संस्कृति में भी पर्याप्त ऑक्सीजन हस्तांतरण प्रदान करेगा । इस दृष्टिकोण के साथ, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट कोशिकाओं को उच्च कोशिका व्यवहार्यता का त्याग किए बिना कोशिकाओं के दोहरीकरण समय की एक सामान्य सीमा के भीतर उच्च झटकों की गति से सुसंस्कृत किया जा सकता है।
इस प्रकार, 6 साल पहले, हमने सेल रखरखाव के दौरान एक मिलाते हुए फ्लास्क में निलंबन संस्कृति की मात्रा बढ़ाना शुरू किया और स्पंदन स्थितियों(चित्रा 6)को समायोजित और निगरानी करते हुए प्रोटीन उत्पादन के लिए एक अलग प्रकार का संस्कृति पोत पेश किया। इन संस्कृति जहाजों में इष्टतम स्थितियों को स्थापित करने के लिए, हमने सेल व्यवहार्यता, आकार और आकार, एकत्रीकरण की स्थिति और कोशिकाओं की संक्रमितता के साथ सेल दोहरीकरण समय जैसे एसएफ9 सेल संस्कृति मापदंडों की निगरानी की।
उदाहरण के लिए, Sf9 सेल रखरखाव के लिए, 2.8 एल फर्नबाख शेक फ्लास्क में, हम 2 एल के बजाय एसएफ9 निलंबन कोशिकाओं के 0.8 एल 27 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर मिलाते हुए और सेल व्यवहार्यता 99% के करीब है, समान रूप से आकार के स्वस्थ विभाजन कोशिकाओं के साथ। स्केल-अप उत्पादन के लिए, हम 25 डिग्री सेल्सियस के कम तापमान पर 145 आरपीएम के रूप में उच्च गति से मिलाते हुए 5 एल रिएजेंट बोतलों में 4 एल कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। बिल्ट-इन झटकों वाले मंच के साथ सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले इनक्यूबेटर 6 x 2.8 एल शेक फ्लास्क या 6 x 5 एल रिएजेंट बोतलें, या 10 x 2.5 एल टुनएयर शेक फ्लास्क पकड़ सकते हैं। इस प्रकार, एक मिलाते हुए मंच की क्षमता, अगर हम फर्नबाख शेक फ्लास्क और रिएजेंट बोतलों को भरने के लिए 1/3 बनाम जहाजों की उच्च भरने की मात्रा के लिए ४.८ एल बनाम 12 एल का उपयोग कर २.८ एल फर्नबाख शेक फ्लास्क और 10 एल बनाम 24 एल 5 एल reagent बोतलों(चित्रा 6)का उपयोग कर । निलंबन सेल संस्कृति रखरखाव और एक उच्च भरने की मात्रा के साथ संस्कृति जहाजों में पैमाने पर उत्पादन हमें उत्पादन की मात्रा की सीमाओं को दूर करने और एक बड़े पैमाने पर मंच अपनाने में मदद मिली है । इस प्रकार, यह प्रयोगशालाओं के लिए अत्यधिक उपयोगी है जिसमें उत्पादन पाइपलाइनों में बायोरिएक्टर और/या सीमित स्थान तक पहुंच नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल को उपयुक्त रेजिन का उपयोग करके और शुद्धिकरण बफ़र्स को संशोधित करके विभिन्न आत्मीयता टैग के साथ प्रोटीन निर्माणों के उत्पादन और शुद्धिकरण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है जैसा कि एसजीसी प्रकाशित पेपर6 में PRMT4, 7, 9 के फ्लैग-टैग पूर्ण लंबाई प्रोटीन और उनके टैग किए गए PRMT5-MEP50 जटिल और PRMT6 के लिए वर्णित किया गया है। हालांकि हम प्रोटीन के पीआरएमटी परिवार के लिए एक BEVS प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, एक ही दृष्टिकोण किसी भी अन्य प्रोटीन परिवार के लिए लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक पांडुलिपि और हमारे सभी एसजीसी सहयोगियों पर मूल्यवान प्रतिक्रिया और महत्वपूर्ण टिप्पणियां प्रदान करने के लिए समय लेने के लिए डालिया Barsyte-Lovejoy का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, जिन्होंने बाकुलोवायरस अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम से व्यक्त की गई पीआरएमटी प्रोटीन परिवार के साथ काम किया।
एसजीसी एक पंजीकृत चैरिटी (संख्या 1097737) है जो AbbVie, बायर एजी से धन प्राप्त करता है, बोहरिंगर इंगलहेम, जेनेटेक, जीनोम कनाडा ओंटारियो जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट [ओजीआई-196], इनोवेटिव मेडिसिन्स इनिशिएटिव 2 ज्वाइंट अंडरटेकिंग [ईउबोपेन ग्रांट 875510], जानसेन, मर्क केगाए (कनाडा और अमेरिका में उर्फ ईएमडी), फाइजर, लेदा और वेलकम ट्रस्ट [106169/14/Z]।
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |