Denne protokol beskriver ændringer af Langendorff-metoden, herunder dybden af aorta cannulation til samtidig isolering af atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus.
En enkelt kardiomyocyt er et vigtigt redskab i de cellulære og subcellulære niveau undersøgelser af hjertebiologi og sygdomme som en grundlæggende enhed for sammentrækning og elektrisk aktivitet. Derfor isolere levedygtige, høj kvalitet kardiomyocytter fra hjertet er det første og mest afgørende eksperimentelle skridt. Sammenligning af de forskellige protokoller for isolering af kardiomyocytter af voksne mus, langendorff retrograd perfusion er den mest succesfulde og reproducerbare metode rapporteret i litteraturen, især for isolere ventrikulære myocytter. Det er dog stadig en udfordring atolating kvalitet atrie myocytter fra perfused hjertet, og få vellykkede isolationsrapporter er tilgængelige. Løsning af dette komplicerede problem er yderst vigtigt, fordi bortset fra ventrikulær sygdom, atriesygdom tegner sig for en stor del af hjertesygdomme. Derfor er yderligere undersøgelser på celleniveau for at afsløre mekanismerne berettiget. I dette papir, en protokol baseret på Langendorff retrograd perfusion metode er indført, og nogle ændringer i dybden af aorta cannulation og de trin, der kan påvirke fordøjelsesprocessen for at isolere atrie og ventrikulære myocytter blev samtidig foretaget. Desuden er de isolerede kardiomyocytter bekræftet at være modtagelige for patch klemme undersøgelse.
Hjertesygdomme er en af de førende globale årsager til dødelighed1. For at imødegå denne byrde på sundhedssystemet er en dybdegående forståelse af hjertets fysiologi og patologi afgørende. Udover hele dyr og intakt hjerteforberedelse er cellulær forberedelse et andet uundværligt værktøj til funktionel og sygdomsundersøgelse2. Ved at anvende plaster klemme, calcium imaging, molekylær biologi, og andre avancerede teknologier, forskere kan få mere information om de elektrofysiologiske egenskaber, calcium homøostase, signalering veje, metaboliske tilstande, og gen transskriptioner i en enkelt kardiomyocyt (CM). Dette er yderst nyttigt at afsløre de fysiologiske og patologiske mekanismer i hjertesygdomsprocessen3,4,5,6,7. Til dyreforsøg kan der anvendes arter lige fra små (f.eks. mus, rotter og marsvin) til store (f.eks. kaniner og hunde) dyr. Små dyr foretrækkes normalt, især mus, fordi de er modtagelige for genetisk og sygdomsmodelmanipulation8,9,10.
Teknikker til akut isolerede CMs har gennemgået en lang udviklingsperiode og er stadig under udvikling11. Langendorff retrograd perfusion er den mest succesfulde og reproducerbare CMs isolationsmetode, der anvendes hos rotter og mus, især til isolering af ventrikulære myocytter (VM’er)12,13,14,15. Men rapporter om vellykkede isolerede atrie myocytter (AM’er) er knappe16,17,18. Yderligere undersøgelser på begge niveauer af hele organ /system og cellulære / subcellulære at afsløre mekanismerne og udforske nye terapeutiske tilgange er berettiget, fordi atrieflimren (AF), den mest almindelige form for arytmi, i stigende grad bliver udbredt globalt, og nuværende behandlingsmetoder i både farmakologiske behandlinger og hjerteablation forbliver ineffektiv hos ca. 40%-50% af AF patienter19 . Vellykket voksen mus CMs isolation er det første skridt for cellulære undersøgelse. To primære isolationsmetoder kan anvendes: chunk og Langendorff metoder. I Langendorff perfusionsmetoden afhænger væv fordøjelsen af enzymet løsning leveret af kranspulsårerne og deres grene til kapillær senge. En ordentlig aorta cannulation dybde, der kan undgå at trænge ind i aorta ventiler og blokere kranspulsåren ostia er forudsætningen for at opnå en sådan perfusion mønster, som også er det væsentlige skridt for effektiv fordøjelse og ideelle VM udbytte. Det er derfor rimeligt at antage, at aorta cannulationens dybde på samme måde kan påvirke forkamrenes forkamrenes perfusion og endelig påvirke AM-udbyttet. For at teste denne hypotese blev aorta cannulation på forskellige dybder udført, og de tilsvarende AM-udbytter blev sammenlignet. Dataene viste, at aorta cannulationsdybden er direkte relevant for AM-udbyttet. Heri introduceres en protokol til at isolere AM’er og VM’er samtidigt.
Single CM er et værdifuldt og uundværligt værktøj i cellulære niveau undersøgelser af hjertefunktion og sygdomme20. Derfor er isolationen af levedygtige DM’er fra hjerterne det første og mest afgørende skridt. Cellekvalitet er en af de væsentlige determinanter for at udføre vellykkede eksperimenter, især i optiske og elektrofysiologiske eksperimenter. Sammenlignet med CMs af andre dyr, gnaver DM’er er mere sårbare over for iskæmi og hypoxi på grund af en højere koncentration af intracellulære natriumioner, som favoriserer calcium tilstrømning gennem Na +/Ca2 + veksler21. Desuden er antallet af AMs langt mindre end antallet af VM’er; det er således yderst vanskeligt at opnå en vellykket isolation. Langendorff-metoden er fremragende til isolering af mus-VM’er22, men succesraten i isoleringen af AM’er er lav, og få rapporter er tilgængelige. Den korrekte dybde af aorta cannulation er også en væsentlig faktor i at give ideelle VM’er bortset fra temperatur, enzymaktivitet, PH og vandkvalitet, der anvendes til bufferforberedelse. Princippet om Langendorff-metoden bygger på retrograd perfusion af hjertet. Ved perfusion lukkes aortaklappen; derved tvinges perfusatet ind i kranspulsårerne og leverer enzymopløsning gennem kargrenene, og myokardievævet fordøjes jævnt. For at opnå denne form for cirkulationsmønster skal aortaen reservere tilstrækkelig længde til cannulation og ligation, også kanylespidsen må ikke trænge ind i aortaventilerne eller blokere CA ostium. Det er således rimeligt at spekulere i, at dybden af aorta cannulation også er forbundet med atria perfusion, hvilket påvirker fordøjelseseffektiviteten af forkamrene og udbyttet af AM på samme måde. Protokollen præsenteret her bekræftede hypotesen, og afgørende skridt til optimering af celleudbyttet sammen med forslagene er noteret nedenfor.
I trin 1.9 anbefales en stump 20 G kanyle med et hak (eller en omkredsspor), hvorfra afstanden er 1 mm til spidsen. Baseret på vores erfaringer blev kanylens størrelse, der er lidt større end aortaens diameter, fundet for at forhindre kanylespidsen i at punktere aortaventilerne under cannulation, fordi aortaen, der bygger på dens iboende elasticitet, kan tæt passe ind i kanylen og producere friktion, der fungerer som en beskyttende faktor, når man bevæger sig frem eller tilbage justerer kannulationsdybden. Med hensyn til hakkets position vil hjertet let glide af under cannulation på grund af tyngdekraften, hvis det er for tæt på kanylespidsen. Omvendt vil pladsen til justering af cannulationsdybden og ligationspositionen være meget begrænset, hvis det er for langt. Under disse omstændigheder er det bedre at omformulere aortaen mellem den venstre fælles halspulsåre (som den grønne linje i figur 2) for at sikre, at aortaen er lang nok og kan befolkes og ligated ved den opstigende aorta, bedre i trin 3.3. Mens transecting på den stigende aorta, den reserverede længde for cannulation i det mindste kunne sikre kanylen spidsen tæt på aorta roden og vil ikke trænge ind i aorta ventiler efter ligation. Anatomien af aorta og måling af afstanden fra kanylen spids til CA ostium indikerer, at transecting aorta mellem venstre fælles halspulsåren er en ideel position til at opnå en ordentlig aorta cannulation dybde.
Cannulation dybde viste sig at være forbundet med forkamrenes perfusion, som igen fungerer som en dybdeindikator. Figur 4 viser, at atria perfusion er god, når dybden er på den stigende aorta, og begge atrie vedhæng er oppustet. Atria perfusion er imidlertid utilstrækkelig, når dybden er ved (eller nærmer sig) aortaroden, og begge atrievedhæng er wizened. Det samlede og levedygtige antal AM, der blev givet fra de oppustede atrievedhæng, var højere (figur 8). Disse resultater tyder på, at aorta cannulation dybde kan påvirke perfusion og fordøjelse af forkamrene og atrie vedhæng på en bestemt måde og endelig påvirke AM udbytte og kvalitet. Udbyttet og kvaliteten af AM blev udledt til at være forbundet med fordelingen af de fartøjer, der leverer forkamrene. Undersøgelsen af Fernández et al.23 har vist forskellige uregelmæssigheder i oprindelsen og forløbet af mus CA. De fandt, at DE’er ostia var meget varierende og ikke alle var placeret i aorta sinus. Nogle CAs kan stamme unormalt ovenfra aorta bihuler, opkaldt den høje start ostium. Nogle CAs kan stamme fra den samme aorta sinus, og ostium af atrium fartøj er lige i nærheden. Anatomien af aorta i denne undersøgelse (figur 10) er også i overensstemmelse med konstateringen af Fernández. Dette kan være årsagen til, at forsøg på at isolere AM ved Langendorff-metoden stort set har været forgæves, hvis cannulationsdybden ikke er passende. Således vil kanylespidsen have en større chance for at blokere atriumfartøjets ostium, der støder op til CA ostium, hvis der ikke er tilstrækkelig plads mellem kanylespidsen og CA ostium. I modsætning hertil blev ventrikelens perfusion og celleudbytte næppe påvirket, så længe aortaventilerne ikke blev gennemtrængt af kanylespidsen. Dette skyldes sandsynligvis, at de CAs, der leverer blod til ventrikel har større ostia og mere oprindelse. Hvis en ostium blev okkluderet af kanylen, kan ventrikelperfusion kompenseres af en anden CA eller sikkerhedsstillelsen, mens blodkarret, der leverer atriummet, er ret lille og har ingen erstatning. Således er dybdens indflydelse i aorta cannulation vigtig.
Andre bemærkelsesværdige faktorer og problemer skyderier i fordøjelsen og celle opbevaring proces er opført som følger. Først skal du overveje at perfusing iltet Tyroders opløsning i trin 4.1 for at gøre muskelkontrakten og pumpe ud resterende blod, hvis blodet i forkamrene ikke er blevet hastet ud efter aorta ligation. Dette kan hjælpe med at undgå den negative virkning af ca2+ og andre materialer, der frigives fra de beskadigede erythrocytter. For det andet kan perfusing ca2 +-fri løsning i forvejen til at adskille forbindelsen og udvide afstanden mellem celler forbedre effekten af enzym fordøjelsen, fordi interkalkede diske mellem DM’er er calcium-afhængige intercellulære vejkryds. Tiden bør dog begrænses til 3-5 min for at undgå calciumparadoksfænomenet24. En blandet enzymopløsning anbefales. Kollagenase type II forstyrrer den ekstracellulære matrix netværk, og trypsin hjælper med at rydde det granulære materiale, der forbliver på celleoverfladen, hvis kollagen ii fordøjelsen er ufuldstændig. Dette sikrer en glat celleoverflade, som er afgørende for at danne en GΩ-forsegling i plasterklemmeoptagelsen. Ikke desto mindre bør trypsinkoncentrationen kontrolleres i det rette interval for at undgå over fordøjelse og celleskade, fordi det kan nedbryde membranproteinet. Ved hjælp af kollagenase type II alene for at forbedre celleudbyttet kan ofte føre til væv over fordøjelsen, og de isolerede DM’er vil være calcium intolerant efter langvarig kollagenase eksponering25. Brugen af 2,3-butanedion monoxime (BDM), et stof, der forhindrer spontan sammentrækning ved at hæmme myosin ATPase og forhindre cross-bridge dannelse, er stadig kontroversielt26,27,28,29. Ifølge tidligere erfaringer er det nødvendigt at tilføje BDM for denne protokol. Enzymopløsning fremstilles med opløsning 1, selvom opløsning 1 ikke indeholder calcium, og calcium tilsættes for at aktivere enzymet. Fordelen ved at tilsætte BDM i perfusionsopløsningen omfatter (1) hæmmende myocytter sammentrækning og reduktion af iltforbruget under enzymopløsningsperfusion og (2) forebyggelse af myocytter fra hypoxi og forbedring af kvaliteten af de isolerede myocytter. Nogle undersøgelser rapporterede, at BDM kan have en potentiel negativ indflydelse på cellulære elektriske egenskaber. Resultaterne af helcelletlappernes fast registrering af natriumstrømmen indikerede imidlertid ikke en uønsket virkning. I celleopbevaringstrinnet (trin 6) har talrige undersøgelser valgt KB-bufferen, en calciumfri, men høj kaliumkoncentrationsopløsning, hvor celler kan opretholde en bedre tilstand, fordi de er i polariserede og lave metaboliske forhold. Imidlertid vil glykokalyksen af cellemembranen adskilles fra lipid-bilayeren i mangel af udefrakommende calcium i en vis periode, og membranens permeabilitet vil stige, hvilket påvirker den efterfølgende funktionelle analyse30,31,32.
Alle myocytter isolation teknikker kan hovedsagelig kategoriseres i øjeblikket i enten luns (et lille stykke væv) fordøjelse i en enzymatisk løsning eller CA perfusion med enzymatisk løsning (Langendorff perfusion)22. Sammenlignet med Langendorff-metoden er chunk-fordøjelsesmetoden lettere at udføre og bruges også rutinemæssigt til isolering af CMs i mange laboratorier. Denne metode giver dog normalt et lavt udbytte af DM’er af dårlig kvalitet fra voksenvæv22. Desuden er celler, der er isoleret ved denne metode, muligvis ikke egnede til at udføre sammenlignende eksperimenter. Når du f.eks. tester de celletypespecifikke lægemiddeleffekter mellem AM og VM, kan virkningen af forskellige isolationsforhold ikke overses eller udelukkes. Dette skyldes, at myokardiet og vævstætheden af ventrikel er meget tykkere og tættere end atriummet, hvilket resulterer i forskellige fordøjelsestider og enzymkoncentrationer. Desuden vil overdreven agitation og pipettering af vævet under fordøjelsen beskadige cellerne og påvirke funktionelle undersøgelser betydeligt. Desuden har mange tidligere undersøgelser vist, at AM’er er mere sårbare over for calcium. Men, AM’er isoleret af den nuværende protokol kan være tolerante over for gradient calcium genindførelse sandsynligvis fordi vævet er let at briste i slutningen af fordøjelsesprocessen. Således er mekanisk skade mindre, mens celler ville lide mere mekaniske skader, da trin i chunk-metoden skal gentagne brud og centrifugal. For nylig rapporterede Ackers et al.33 en forenklet, Langendorff-fri metode til isolering af levedygtige hjertemyocytter og nonmyocytter. VM’erne og fibroblast kan isoleres effektivt, men mængden af AM’erne blev ikke nævnt. Denne protokol har dog flere begrænsninger. For det første kan fordelingen af hjerte blodkarrene have variationer for individuelle forskelle og mus stamme, og den anbefalede cannulation dybde kan ikke garantere en vellykket AMs isolation for hver gang. For det andet kan det tage en vis tid for dem, der er nye i denne procedure, at praktisere aortatransektion og retrograd aorta cannulation. Endelig blev denne metode ikke testet i andre hjertesygdomsmodeller undtagen hos raske og ældre mus. Derfor vil det kræve justeringer i enzym koncentrationer og tidspunktet for fordøjelsen på grund af hjertets fibrose omfang. Ulempen ved forskellige fordøjelsesforhold, der opstår i chunk-metoden, vil ikke være et problem i Langendorff-metoden, hvor enzymopløsningen fordeles jævnt til vævet af karbedene.
Sammenfattende har protokollerne for samtidig isolering af enkelt AM og VM beskrevet her vist, at den korrekte aorta cannulation dybde effektivt kan forbedre atrium perfusion og AM udbytte. De CMs isoleret ved denne metode er af høj kvalitet, besidder god calcium tolerance, og er blevet anvendt med succes til patch klemme optagelse og calcium håndtering (Ca2 + frigivelse og Ca2 + bølge måling af IonOptix system) i team34. Det forventes, at isolationsprotokollen kan bruges til celleforberedelse i en række cellulære og subcellulære undersøgelser, hvilket vil bidrage til at uddybe forståelsen af hjertefysiologi og patologi. Det er vigtigt, at det vil gøre det muligt at opdage mere klinisk relevante hjertesygdomsmekanismer og interventionsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Nr. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) og Beijing Natural Science Foundation (nr. 7192051). Forfatter bidrag: Bai og Liu designet og udtænkt projektet. Wen og Ruan gav værdifulde råd til eksperimenterne. Wu og Linling Li udførte det eksperimentelle arbejde og spillede nøgleroller inden for dataindsamling, analyse og fortolkning. Li deltog i Langendorff apparatet samles. Peng, Zhang, Wang og Yang deltog i forberedelsen af reagenser og løsninger før eksperimentet. Wu skrev artiklen.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |