वयस्क चूहों से एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए लैंगेनडॉर्फ विधि के संशोधन

Summary

यह प्रोटोकॉल लैंगेनडॉर्फ विधि के संशोधनों का वर्णन करता है जिसमें वयस्क चूहों से अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए महाधमनी कैनुलेशन की गहराई शामिल है।

Abstract

एक एकल कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन और विद्युत गतिविधि की एक मौलिक इकाई के रूप में कार्डियक जीव विज्ञान और बीमारियों के सेलुलर और उपकोशिकीय स्तर के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। इसलिए, हृदय से व्यवहार्य, उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना प्रारंभिक और सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम है। वयस्क चूहों के कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल की तुलना करते हुए, लैंगेनडॉर्फ प्रतिगामी परफ्यूजन साहित्य में रिपोर्ट की गई सबसे सफल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि है, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने के लिए। हालांकि, perfused दिल से गुणवत्ता एट्रियल मायोसाइट्स को अलग करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, और कुछ सफल अलगाव रिपोर्ट उपलब्ध हैं। इस जटिल समस्या को हल करना बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि वेंट्रिकुलर रोग के अलावा, अलिंद रोग हृदय रोगों के एक बड़े हिस्से के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, तंत्र को प्रकट करने के लिए सेलुलर स्तर पर आगे की जांच की आवश्यकता है। इस पेपर में, लैंगेनडॉर्फ प्रतिगामी परफ्यूजन विधि पर आधारित एक प्रोटोकॉल पेश किया गया है और महाधमनी कैनुलेशन की गहराई में कुछ संशोधन और अलिंद और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को अलग करने के लिए पाचन प्रक्रिया को प्रभावित करने वाले चरणों को एक साथ बनाया गया था। इसके अलावा, पृथक कार्डियोमायोसाइट्स को पैच क्लैंप जांच के लिए सक्षम होने की पुष्टि की जाती है।

Introduction

कार्डियक रोग मृत्यु दर के प्रमुख वैश्विक कारणों में से एक है^। स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली पर इस बोझ को संबोधित करने के लिए, दिल के शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान की गहराई से समझ आवश्यक है। पूरे जानवर और बरकरार दिल की तैयारी के अलावा, सेलुलर तैयारी कार्यात्मक और रोग अध्ययन ² के लिए एक और अपरिहार्य उपकरण है। पैच क्लैंप, कैल्शियम इमेजिंग, आणविक जीव विज्ञान और अन्य उन्नत प्रौद्योगिकियों को लागू करके, शोधकर्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों, कैल्शियम होमियोस्टैसिस, सिग्नलिंग मार्गों, चयापचय राज्यों और जीन ट्रांसक्रिप्शन के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं एक ही कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम)। यह हृदय रोग प्रक्रिया के शारीरिक और रोग तंत्र को प्रकट करने में बेहद सहायक ^{है3,4,5,6,7}। पशु अनुसंधान के लिए, छोटे (जैसे, चूहों, चूहों और गिनी सूअरों) से लेकर बड़े (जैसे, खरगोश और कुत्तों) जानवरों तक की प्रजातियों का उपयोग किया जा सकता है। छोटे जानवरों को आमतौर पर पसंद किया जाता है, विशेष रूप से चूहों, क्योंकि वे आनुवंशिक और रोग मॉडल हेरफेर ^8,9,10 के लिए उपयुक्त हैं।

तीव्र रूप से अलग-थलग सीएम की तकनीकों ने एक लंबी विकास अवधि का सामना किया है और अभी भी विकसित हो रहे हैं^। Langendorff प्रतिगामी परफ्यूजन चूहों और चूहों में लागू सबसे सफल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य सीएम अलगाव विधि है, विशेष रूप से वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (वीएम) को अलग करने के लिए 12,13,14,15। हालांकि, सफलतापूर्वक अलग-थलग अलिंद मायोसाइट्स (एएम) की रिपोर्ट दुर्लभ ^16,17,18 हैं। तंत्र को प्रकट करने और नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों का पता लगाने के लिए पूरे अंग / प्रणाली और सेलुलर / उपकोशिकीय दोनों स्तरों पर आगे की जांच वारंट की जाती है क्योंकि अलिंद फिब्रिलेशन (एएफ), अतालता का सबसे आम प्रकार, तेजी से विश्व स्तर पर प्रचलित हो रहा है, और फार्माकोलॉजिकल थेरेपी और कार्डियक एब्लेशन दोनों में वर्तमान उपचार के तरीके लगभग 40% -50% रोगियों में अप्रभावी रहते हैं ^AF19 . सफल वयस्क माउस सीएम अलगाव सेलुलर अध्ययन के लिए पहला कदम है। दो प्राथमिक अलगाव विधियों का उपयोग किया जा सकता है: चंक और लैंगेनडॉर्फ विधियां। Langendorff परफ्यूजन विधि में, ऊतक पाचन कोरोनरी धमनियों और केशिका बिस्तरों के लिए उनकी शाखाओं द्वारा वितरित एंजाइम समाधान पर निर्भर करता है। एक उचित महाधमनी कैनुलेशन गहराई जो महाधमनी वाल्वों को भेदने से बच सकती है और कोरोनरी धमनी ओस्टिया को अवरुद्ध कर सकती है, इस तरह के एक परफ्यूजन पैटर्न को प्राप्त करने की शर्त है, जो कुशल पाचन और आदर्श वीएम उपज के लिए भी आवश्यक कदम है। इसलिए, यह मानना उचित है कि महाधमनी कैनुलेशन की गहराई इसी तरह एट्रिया पोत के परफ्यूजन को प्रभावित कर सकती है और अंत में एएम उपज को प्रभावित कर सकती है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, विभिन्न गहराई पर महाधमनी कैनुलेशन किया गया था और संबंधित एएम पैदावार की तुलना की गई थी। डेटा से पता चला है कि महाधमनी cannulation गहराई सीधे एएम उपज के लिए प्रासंगिक है। इसमें, एएमएस और वीएम को एक साथ अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया गया है।

Protocol

वयस्क पुरुष C57BL / 6 चूहों का वजन 20-30 ग्राम, 8-10 सप्ताह की उम्र के पशु केंद्र से कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी, बीजिंग, चीन से खरीदा गया था। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु संसाधन संस्थान द्वारा प्रस्तावित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा प्रकाशित किया गया था। Excel और Origin 8.5 का उपयोग डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए किया गया था। डेटा को एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए, छात्र के टी परीक्षण का उपयोग किया गया था और पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। 1. समाधान और परफ्यूजन उपकरण तैयारी एक निरंतर प्रवाह Langendorff उपकरण (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या स्व-निर्मित) को इकट्ठा करें। चित्रा 1 एक सरल योजनाबद्ध प्रदान करता है। तालिका 1 और तालिका 2 में दिए गए अभिकर्मकों के अनुसार समाधान तैयार करें। परिसंचारी पानी के स्नान को चालू करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त इनपुट तापमान (हमारी प्रयोगशाला में 42.7 डिग्री सेल्सियस) को समायोजित करें कि कैनुला से परफ्यूसेट परिसंचरण प्रणाली का बहिर्वाह 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है। विआयनीकृत पानी को परिसंचारी करके परफ्यूजन प्रणाली को साफ करें। यदि एक बाँझ स्थिति की आवश्यकता होती है, तो 15 मिनट के लिए परफ्यूजन सिस्टम के माध्यम से 75% इथेनॉल चलाएं, इसके बाद विआयनीकृत पानी (दिल पर शराब विषाक्तता प्रभाव से बचने के लिए कम से कम 10 चक्र)। परफ्यूजेट परिसंचरण प्रणाली के एक चक्र के लिए समय और मात्रा को मापने के लिए यह निर्धारित करने के लिए कि निम्नलिखित परफ्यूजन चरण में लोड किए जाने वाले ऑक्सीजनयुक्त टायरोड के समाधान के कितने मिलीलीटर हैं। वांछित विधि में सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। परफ्यूसेट परफ्यूजन सिस्टम की प्रवाह दर को 4 एमएल / मिनट पर सेट करें। दो साफ 35 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें- एक में टायरोड का समाधान (पेट्री डिश 1) शामिल है, दूसरा समाधान 1 (पेट्री डिश 2) युक्त है। समाधान 1 और एक 20 जी कुंद स्टील कैनुला सुई से भरा एक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें, जहां से दूरी टिप के लिए 1 मिमी है। प्रवेशनी शाफ्ट के लिए 3-0 टांके के साथ एक ढीली गाँठ तैयार करें। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के देखने के क्षेत्र को विनियमित करें और सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी टिप पेट्री डिश 2 की तरल सतह के नीचे है। 2. पशु तैयारी रक्त के थक्कों से बचने के लिए चूहों को इंट्रापेरिटोनियल रूप से हेपरिन (एकाग्रता, 1,000 आईयू / एमएल; 0.2 एमएल / माउस) का प्रशासन करें। 10 मिनट के बाद, सोडियम पेंटोबार्बिटल (50 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी इंजेक्शन) के साथ चूहों को एनेस्थेटिक करें और सुनिश्चित करें कि चूहे पूंछ / पैर की अंगुली के चुटकी का जवाब देना बंद कर दें। हेपरिन प्रशासन के 20 मिनट बाद गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन करें। चूहों को सर्जिकल प्लेटफ़ॉर्म पर स्थानांतरित करें, चूहों को एक सुपाइन स्थिति में ठीक करें, 75% इथेनॉल के साथ छाती को निष्फल करें, और इसे धुंध या नैपकिन के साथ सुखाएं। 3. दिल उच्छेदन और महाधमनी तोप ऊतक संदंश के साथ xiphoid की त्वचा को उठाएं और ऊतक कैंची के साथ त्वचा के माध्यम से एक मामूली पार्श्व चीरा बनाएं। त्वचा और प्रावरणी के बीच एक कुंद विच्छेदन करें और दोनों पक्षों पर एक्सिले की ओर वी-आकार में त्वचा के चीरे का विस्तार करें। रिब पिंजरे के माध्यम से एक ही चीरा ट्रेस जारी रखें, और फिर, दिल और फेफड़ों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए ऊतक संदंश के साथ उरोस्थि को क्लैंप करके रिब पिंजरे को ऊपर की ओर विक्षेपित करें। एक घुमावदार संदंश का उपयोग करके पेरिकार्डियम को छील लें। थाइमस ग्रंथि को दो घुमावदार संदंश द्वारा दोनों पक्षों की ओर फाड़ दें यदि यह महान जहाजों को कवर करता है। धीरे से घुमावदार संदंश के साथ पूंछ की ओर हृदय के आधार को खींचें जब तक कि “वाई” आकार की रक्त वाहिका (महाधमनी और इसकी शाखा धमनियों) को नहीं देखा जा सकता है। कैनुलेशन और तुलना के लिए महाधमनी की विभिन्न लंबाई को आरक्षित करने के लिए, महाधमनी को बाईं आम कैरोटिड धमनी ( चित्रा 2 में हरी रेखा) पर ट्रांसेक्ट करें और कुछ चूहों में एक ही समय में ब्रैकियोसेफलिक धमनी को काटें। अन्य चूहों में आरोही महाधमनी पर transact ( चित्र2 में काली रेखा).नोट: उन लोगों के लिए जो इस प्रक्रिया के लिए नए हैं, यह चरण स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत भी किया जा सकता है। दिल को एक्साइज करें, और तुरंत अवशिष्ट रक्त को धोने और पंप करने के लिए पेट्री डिश 1 में विसर्जित करें। पेट्री डिश 2 में दिल को स्थानांतरित करें, और यदि आवश्यक हो तो ठीक आईरिस कैंची का उपयोग करके किसी भी अधिशेष ऊतक को ट्रिम करें। उन लोगों के लिए जो इस प्रक्रिया के लिए नए हैं, महाधमनी या अन्य हृदय संरचनाओं को गलत तरीके से काटने से बचने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत इस कदम को करें। महाधमनी cannulation से पहले हवा के बुलबुले निष्कासित करने के लिए सिरिंज पुश. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत दो सीधे बांधने वाले संदंश (चिकनी जबड़े) की सहायता से प्रतिगामी महाधमनी कैनुलेशन करें। सुनिश्चित करें कि पूरी कैनुलेशन प्रक्रिया तरल सतह के नीचे है। महाधमनी वाल्व में प्रवेश करने से बचें और आरोही महाधमनी (माउस है कि महाधमनी बाएं आम कैरोटिड धमनी पर transacted था) और महाधमनी जड़ (माउस है कि महाधमनी आरोही महाधमनी पर transacted किया गया था), क्रमशः करने के लिए गहराई को समायोजित करने से बचें।नोट: महाधमनी cannulation की गहराई (बस गहराई के रूप में के रूप में संदर्भित) यहाँ स्थिति जहां cannula टिप महाधमनी में है या जहां महाधमनी ligated है के रूप में परिभाषित किया गया है. पूर्व गाँठ 3-0 सीवन के साथ महाधमनी ligate प्रवेशनी पायदान के लिए. अवशिष्ट रक्त को कुल्ला करने के लिए सिरिंज सामग्री को धीरे से दबाएं।नोट: रक्त कोरोनरी धमनियों को छोड़ देगा और पृष्ठीय नसों से बहाव करेगा यदि गहराई ठीक से स्थित है। दिल और अलिंद उपांगों का विस्तार होगा और पीला हो जाएगा। निकालें और Langendorff उपकरण के लिए cannula कनेक्ट. एक बार फिर, दिल में प्रवेश करने वाले किसी भी हवा के बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें।नोट: ध्यान रखें कि थोराकोटॉमी से प्रारंभिक परफ्यूजन तक का समय 5 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। 4. दिल परफ्यूजन सबसे पहले, लगभग 10 s के लिए प्राइम और परफ्यूज ऑक्सीजनयुक्त टायरोड का समाधान (इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सिस्टम में 10 s चलने वाले तरल की मात्रा लगभग 0.7 मिलीलीटर है) यदि एट्रिया में अवशिष्ट रक्त है, और फिर समाधान 1 पर स्विच करें। हालांकि, बस समाधान 1 के साथ perfuse यदि वहाँ atria में कोई अवशिष्ट रक्त है. लगभग 2 मिनट के लिए दिल को परफ्यूज करें। समाधान 3 पर स्विच करें. एक एकल-उपयोग बाँझ पॉलीथीन पिपेट के साथ समाधान 3 के बारे में 2.5 मिलीलीटर चूसें और बाद में उपयोग के लिए पानी के स्नान में इसे प्रीवार्म करें, शेष लगभग 11-12 मिनट के लिए परफ्यूजन के लिए उपयोग किया जाता है। पहले 2 मिनट में समाधान 3 perfused छोड़ें। पाचन पूरा होने तक पुन: उपयोग के लिए peristaltic पंप द्वारा perfusate जलाशयों के लिए बाकी रीसायकल. पाचन को समाप्त करें जब दिल सूजा हुआ हो जाता है और थोड़ा पीला और फ्लैक्सीड (स्पंजी बनावट) हो जाता है या एक छाप मौजूद होती है यदि मायोकार्डियम को दांतेदार संदंश का उपयोग करके धीरे से चुटकी ली जाती है। 5. सेल अलगाव और कैल्शियम reintroduction संदंश के साथ वेंट्रिकल और एट्रिया को हटा दें, और उन्हें विभिन्न पेट्री व्यंजनों में रखें। पेट्री व्यंजन ों के लिए prewarmed समाधान 3 जोड़ें. कुंद संदंश के साथ ऊतक को एक टर्बिड बनावट में विभाजित करें और यहां तक कि पाचन के लिए ऊतक को धीरे से पिपेट करें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचें। शेष एंजाइम गतिविधि को गिरफ्तार करने के लिए समाधान 4 में पिपेट के साथ टर्बिड पचे हुए ऊतक को स्थानांतरित करें, और फिर 192×g पर 20 s के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए सेल तलछट और पिपेट में समाधान 5 जोड़ें। कैल्शियम विरोधाभास और कैल्शियम अधिभार से बचने के लिए एक चरणबद्ध तरीके से कैल्शियम को फिर से पेश करें। धीरे-धीरे सेल निलंबन के लिए कुल 50 μL 100 mM / L CaCl2 (क्रमशः 5 μL, 10 μL, 15 μL, और 20 μL के प्रत्येक 5 मिनट के अंतराल पर) जोड़ें। 6. सेल भंडारण पैच क्लैंप अध्ययन के लिए, Tyrode के समाधान में कोशिकाओं को स्टोर करें। अन्य सेलुलर अध्ययनों के लिए, समाधान 6 में कोशिकाओं को संग्रहीत करें। तीव्र कार्यात्मक अध्ययनों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए ‘(उदाहरण के लिए, Ca2+ स्पार्क्स, Ca2+ तरंगें, Ca2+ रिलीज, Ca2+ रिसाव, और पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग) परिणाम, अगले 6 ज के भीतर इस प्रकार के कार्यात्मक प्रयोगों को समाप्त करें।

Representative Results

यह पेपर, जहां कैनुला टिप को महाधमनी में तैनात किया जाता है, जिसे महाधमनी कैनुलेशन की गहराई के रूप में परिभाषित किया जाता है (जिसे केवल गहराई के रूप में संदर्भित किया जाता है), यह भी दर्शाता है कि महाधमनी कहां है। एएम और वीएम को एक दिल से अलग किया गया था जिसे आरोही महाधमनी पर कैनुलेटेड और लिगेट किया गया था, क्रमशः एएमएए और वीएमएए के रूप में दर्शाया गया है। इसके अलावा, एएम और वीएम को एक दिल से अलग किया गया था जिसे महाधमनी जड़ पर कैनुलेटेड और लिगेट किया गया था, क्रमशः अमर और वीएम के रूप में दर्शाया गया है। चित्रा 2 महाधमनी और transection पदों का सिंहावलोकन से पता चलता है. इसके अलावा, चित्रा 3 गहराई और बंधाव स्थानों को दर्शाता है जो महाधमनी ट्रांसेक्शन पदों के अनुरूप हैं। गहराई एट्रिया और एट्रियल उपांगों के परफ्यूजन से जुड़ी हुई थी। दोनों अलिंद उपांगों को फुलाया जाता है जब कैनुला टिप आरोही महाधमनी पर होती है, जो पर्याप्त एट्रिया परफ्यूजन का संकेत देती है। हालांकि, जब महाधमनी जड़ में, एट्रिया परफ्यूजन अपर्याप्त होता है और दोनों अलिंद उपांगों को विज़ेन किया जाता है (चित्रा 4)। सीएम आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता जो कैल्शियम पुन: परिचय के बाद विभिन्न गहराई पर कैनुलेटेड दिलों से अलग हो जाती है (चित्रा 5)। AMAA, AMAR, VMAA, और VMAR के सेल morphologies कैल्शियम reintroduction से पहले और बाद में confocal माइक्रोस्कोप के तहत हैं। एएम स्पिंडल के आकार के होते हैं, जबकि वीएम आयताकार सिरों के साथ रॉड के आकार के होते हैं। इसके अलावा, एएम और वीएम में बरकरार झिल्ली, स्पष्ट रूपरेखा, स्पष्ट स्ट्राइटेड सार्कोमेरेस और चिकनी-सतह (चित्रा 6) हैं। सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग के माध्यम से किया गया था। बरकरार झिल्ली के साथ सामान्य कोशिकाएं ट्रिपैन नीले रंग को बाहर कर सकती हैं और दाग नहीं होंगी, जबकि कोशिकाओं की हानि गतिविधि इंट्रासेल्युलर रूप से जल्दी से ट्रिपैन ब्लू (चित्रा 7) जमा करेगी। कक्ष गणना करने के लिए एएमएस और वीएम को विभिन्न ऑब्जेक्ट स्लाइड्स में रखा गया था। एएम की कुल पैदावार और व्यवहार्य स्पिंडल के आकार के सीएम (उत्तरजीविता दर) का प्रतिशत सेल निलंबन के 10 μL को एक ऑब्जेक्ट स्लाइड में स्थानांतरित करके निर्धारित किया गया था और 4 × 10 क्षेत्रों में एक उलटा चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत गिना गया था। इसी विधि का उपयोग वीएम (रॉड के आकार की) की कुल पैदावार और व्यवहार्य वीएम के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए किया गया था। इस विधि को हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करने पर पसंद किया जाता है, क्योंकि सीएम ने अपने आकार और आकार के कारण हेमोसाइटोमीटर के गिनती क्षेत्र में आसानी से वितरित नहीं किया था। एक बार ग्राफ (चित्रा 8) कैल्शियम reintroduction से पहले और बाद में AMAA, AMAR, VMAA, और VMAR की जीवित रहने की दर को दर्शाता है। प्रत्येक मान 10 चूहों से एसडी ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। कैल्शियम reintroduction से पहले, AMAA की जीवित रहने की दर अमर (70.9% ± 2.8% और 41.0% ± 5.2% की तुलना में काफी अधिक है; पी < 0.01)। कैल्शियम reintroduction के बाद, AMAA की जीवित रहने की दर अमर (69.4% ± 3.0% और 37.7% ± 4.9% की तुलना में काफी अधिक है; पी < 0.01)। VMAA जीवित रहने की दर VMAR (89.5% ± 2.7% बनाम 88.1% ± 2.6% से क्रमशः अलग नहीं थी; पी > 0.05) कैल्शियम reintroduction से पहले. इसी तरह, VMAA जीवित रहने की दर VMAR (82.2% ± 1.9% बनाम 82.9% ± 1.6% से अलग नहीं थी; पी > 0.05) कैल्शियम reintroduction के बाद. इस प्रोटोकॉल की सिफारिश के रूप में गहराई से एक दिल cannulated (आरोही महाधमनी पर), लगभग 4.1 मिलियन और लगभग 180,000 की एक व्यवहार्य VMs उपज, क्रमशः, कैल्शियम reintroduction के बाद। पृथक एएम और वीएम में सोडियम वर्तमान (चित्रा 9 ए, बी) और वर्तमान घनत्व (चित्रा 9 सी) की पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग पुष्टि करती है कि सेल की गुणवत्ता इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए आवश्यकताओं को पूरा कर चुकी है। महाधमनी की शारीरिक रचना (चित्रा 10) से पता चलता है कि अलिंद पोत का ओस्टियम महाधमनी जड़ के पास है और कोरोनरी धमनी (सीए) के ओस्टियम से सटा हुआ है। तालिका 3 कैनुला टिप से दिल के सीए ओस्टियम तक की दूरी को दर्शाती है, जो क्रमशः आरोही महाधमनी और महाधमनी जड़ पर कैनुलेटेड और लिगेटेड होती है। चित्र 1. एक इकट्ठे संशोधित Langendorff प्रणाली की योजनाबद्ध आरेख. यह प्रणाली उपयोगकर्ताओं के लिए किफायती और पोर्टेबल है। इसमें प्लास्टिक ट्यूबिंग के दो हिस्से हैं- एक पानी के लिए (आंतरिक व्यास, 8 मिमी) और एक परफ्यूसेट (आंतरिक व्यास, 1.5 मिमी) के लिए – जिनमें से डिस्टल एंड एक पीई मेडिकल थ्री-वे स्टॉपकॉक से जुड़ा हुआ है, जिसमें से एक ल्यूर लॉक के साथ तीन-तरफा स्टॉपकॉक है। एक कांच की बोतल जिसमें पानी होता है और एक रबर स्टॉपर के साथ एक हीट एक्सचेंजर के रूप में होता है। perfusate पेरिस्टाल्टिक पंप द्वारा हीट एक्सचेंजर में प्लास्टिक टयूबिंग में पंप किया जाता है और प्रवेशनी से जुड़े तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक से बाहर आता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 2. महाधमनी और ऊतकों के आसपास। एक “वाई” के आकार की रक्त वाहिका संरचना महाधमनी और इसकी शाखाएं हैं: ब्रैकियोसेफेलिक धमनी (तीर 1) और बाएं आम कैरोटिड धमनी (तीर 2)। बाएं आम कैरोटिड धमनी (हरी रेखा) के बीच महाधमनी को ट्रांसेक्ट करें और साथ ही साथ कुछ चूहों में ब्रैकियोसेफेलिक धमनी को काट दें; अन्य चूहों में आरोही महाधमनी (काली रेखा) पर ट्रांसेक्ट करें (स्टीरियोमाइक्रोस्कोप 10 × 2 आवर्धन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 3. cannulated दिल का ललाट दृश्य. काली घुमावदार रेखा महाधमनी के कृन्तक किनारे का प्रतिनिधित्व करती है जिसे बाएं आम कैरोटिड धमनी के बीच ट्रांसेक्ट किया गया था। लाल घुमावदार रेखा आरोही महाधमनी पर ट्रांसेक्टेड महाधमनी के कृन्तक किनारे का प्रतिनिधित्व करती है। सीधी रेखा का प्रतिनिधित्व करता है जहां महाधमनी को लिगेट किया गया था: आरोही महाधमनी पर काला और महाधमनी जड़ पर लाल (स्टीरियोमाइक्रोस्कोप 10 × 2 आवर्धन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 4. cannulated दिल की परफ्यूजन स्थिति. एट्रिया पर्याप्त रूप से perfused हैं, और दोनों अलिंद उपांगों को दिल (ए) में फुलाया जाता है और आरोही महाधमनी पर लिगेट किया जाता है। हालांकि, दोनों अलिंद उपांगों को दिल (बी) में विज़ेन किया जाता है और महाधमनी जड़ पर लिगेट किया जाता है, जो गरीब एट्रिया परफ्यूजन का संकेत देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 5. कैल्शियम reintroduction के बाद सेल आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता मूल्यांकन। आरोही महाधमनी पर हृदय कैनुलेटेड और लिगेटेड से अलग किए गए एएम (ए) और वीएम (बी) को क्रमशः एएमएए और वीएमएए के रूप में दर्शाया जाता है। एएमएस (सी) और वीएम (डी) को महाधमनी जड़ में हृदय कैनुलेटेड और लिगेटेड से अलग किया जाता है, क्रमशः एएमएआर और वीएमएआर के रूप में दर्शाया जाता है। उच्च गुणवत्ता वाले सीएम quiescent हैं और बरकरार झिल्ली, स्पष्ट रूपरेखा, स्पष्ट striated sarcomeres, और एक चिकनी सेल सतह है। एएम स्पिंडल के आकार के होते हैं, जबकि वीएम आयताकार सिरों के साथ रॉड या ईंट के आकार के होते हैं। सीएम जो झिल्ली में अनायास अनुबंधित या ब्लेब्स होते हैं, खराब गुणवत्ता के होते हैं, और जो गोलाकार आकार में सिकुड़ते हैं, वे मृत कोशिकाएं होती हैं। दृश्य का एक यादृच्छिक क्षेत्र (प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, 10 × 10 आवर्धन; स्केल बार, 100 μm)। एएम = एट्रियल मायोसाइट्स, वीएम = वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 6. कैल्शियम reintroduction से पहले और बाद में एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान. कैल्शियम reintroduction से पहले, AMAA (A) और AMAR (C) स्पष्ट रूपरेखा, स्ट्राइटेड sarcomeres, और चिकनी झिल्ली सतहों के साथ स्पिंडल के आकार के होते हैं। कैल्शियम reintroduction के बाद, AMAA (बी) और अमर (डी) भी स्पष्ट रूपरेखा, स्ट्राइट सारकोमेरेस, और चिकनी झिल्ली सतहों के साथ स्पिंडल के आकार के होते हैं। कैल्शियम reintroduction से पहले, VMAA (E) और VMAR (G) छड़- या ईंट के आकार के स्पष्ट रूपरेखा, स्ट्राइट sarcomeres, और आयताकार सिरों के साथ चिकनी झिल्ली सतहों के साथ होते हैं। कैल्शियम reintroduction के बाद, VMAA (F) और VMAR (H) भी छड़ या ईंट के आकार के स्पष्ट रूपरेखा, striated sarcomeres, और आयताकार सिरों के साथ चिकनी झिल्ली सतहों (confocal माइक्रोस्कोप तेल, 63 × 10 आवर्धन; स्केल सलाखों, 50 μm) के साथ कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 7. सेल व्यवहार्यता मूल्यांकन. क्षतिग्रस्त कोशिकाएं जो गतिविधि खो देती हैं, उन्हें ट्रिपैन नीले रंग से दाग दिया जाता है। इसके विपरीत, व्यवहार्य कोशिकाओं को ट्राइपैन नीले (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, 4 × 10 आवर्धन; स्केल बार, 100 μm) द्वारा दाग नहीं दिया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 8. बार ग्राफ एएमएए, अमर, वीएमएए और वीएमएआर की जीवित रहने की दर को कैल्शियम पुन: परिचय से पहले और बाद में दिखा रहा है। CR = कैल्शियम reintroduction। प्रत्येक मान 10 चूहों से एसडी ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. घोल सामग्री (mmol/L में अंतिम एकाग्रता, यदि अलग-अलग निर्दिष्ट नहीं है) प्रसिद्घ परफ्यूजन समाधान (समाधान 1) 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurine, 5 Glucose, 10 2,3-butanedione monoxime(BDM) जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। प्रयोग के दिन ग्लूकोज, टॉरिन और बीडीएम जोड़ा जाता है। प्रत्येक दिल के लिए 200 मिलीलीटर परफ्यूजन समाधान तैयार करें। Tyrode का समाधान (समाधान 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 ग्लूकोज जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। CaCl2 और ग्लूकोज प्रयोग के दिन जोड़ा जाता है, पीएच मीटर के साथ कमरे के तापमान (28-30 डिग्री सेल्सियस) पर संतृप्त NaOH के साथ 7.3-7.4 के लिए पीएच समायोजित करें। तालिका 1. वयस्क माउस मुख्यमंत्री अलगाव के लिए समाधान. घोल सामग्री प्रसिद्घ पाचन समाधान (समाधान 3) 25 mL समाधान 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg कोलेजनेस II, 50μL (2.5% 10×) ट्रिप्सिन हर दिल के लिए रोकें समाधान 1(समाधान 4) 9 mL समाधान 1, 1 mL FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम), 4μL 100 mM/ हर दिल के लिए बंद करें समाधान 2(समाधान 5) 9.5 mL समाधान 1, 0.5 mL FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम), 4μL 100 mM/ हर दिल के लिए सेल पुन: निलंबन समाधान (समाधान 6) 13 mL समाधान 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (बुल सीरम एल्ब्यूमिन) एक खुराक पर जो तरल की सतह को कवर करने वाली एक पतली परत बना सकता है हर दिल के लिए तालिका 2. वयस्क माउस मुख्यमंत्री अलगाव और भंडारण के लिए समाधान. चित्र 9. सोडियम चैनलों के वर्तमान-वोल्टेज वक्र। वोल्टेज क्लैंप मोड में पृथक कार्डियोमायोसाइट्स की सोडियम धाराओं को रिकॉर्ड करने के लिए पूरे सेल पैच क्लैंप तकनीकों का उपयोग किया गया था। वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल इनसेट में दिखाया गया है। AM (A) और VM (B) से रिकॉर्ड की गई सोडियम धाराओं को दिखाया गया है। -45mV, −40mV, और −35 mV के विभव पर वर्तमान घनत्व क्रमशः AM (−32.71 ± 1.597 pA/pF, −31.49 ± 1.820 pA/pF, और −29.34 ± 1.939 pA/pF, क्रमशः VM (−17.66 pA/pF) की तुलना में काफी अधिक है; n = 10) VM (−17.66 pA/pF ± ± 1.939 pA/pF की तुलना में± n = 10) पी < 0.05)। (सी) आई-वी वक्र सोडियम वर्तमान घनत्व को दिखाते हैं जिन्हें सेल धारिता के लिए सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्र 10. अलिंद पोत की उत्पत्ति और वितरण। पैनल ए में एट्रियल पोत (तीर 1) और सीए (तीर 2) पैनल बी अलिंद पोत (तीर 3) पर एक करीबी नज़र है। (c) दो अलग-अलग आकार के ostia मौजूद हैं; एक (तीर 4) अलिंद पोत से मेल खाता है जो अलिंद उपांगों को सिंचित करता है, और दूसरा (तीर 5) सीए (स्टीरियोमाइक्रोस्कोप 10 × 5 आवर्धन) से मेल खाता है। CA = कोरोनरी धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चूहों का सीरियल नंबर 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 महाधमनी कैनुलेशन की गहराई आरोही महाधमनी पर है 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 महाधमनी कैनुलेशन की गहराई महाधमनी जड़ पर है 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 तालिका 3. कैनुला टिप से कोरोनरी धमनी ऑस्टियम तक की दूरी। C57BL/6 चूहों (n = 20) के दिलों का उपयोग क्रमशः आरोही महाधमनी और महाधमनी जड़ की गहराई पर महाधमनी को कैनुलेट और लिगेट करने के लिए किया गया था। महाधमनी anatomized है, और कैनुला टिप से सीए ostium के लिए दूरी मापा गया था. दूरी मिलीमीटर में मापा जाता है, और सकारात्मक या नकारात्मक संकेत क्रमशः सीए ऑस्टियम के ऊपर और नीचे कैनुला टिप का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

एकल मुख्यमंत्री कार्डियक फ़ंक्शन और रोगों के सेलुलर स्तर के अध्ययन में एक मूल्यवान और अपरिहार्य उपकरण ^है20। इसलिए, दिल से व्यवहार्य सीएम का अलगाव प्रारंभिक और सबसे महत्वपूर्ण कदम है। सेल की गुणवत्ता सफल प्रयोगों के संचालन के महत्वपूर्ण निर्धारकों में से एक है, विशेष रूप से ऑप्टिकल और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों में। अन्य जानवरों के सीएम की तुलना में, कृंतक सीएम इंट्रासेल्युलर सोडियम आयनों की उच्च सांद्रता के कारण इस्केमिया और हाइपोक्सिया के लिए अधिक कमजोर होते हैं, जो ना ⁺ / ^{Ca2 +} एक्सचेंजर ²¹ के माध्यम से कैल्शियम प्रवाह का पक्ष लेते हैं। इसके अलावा, एएमएस की संख्या वीएम की तुलना में बहुत कम है; इस प्रकार, सफल अलगाव प्राप्त करना बेहद मुश्किल है। Langendorff विधि चूहों ^VMs22 को अलग करने के लिए उत्कृष्ट है, लेकिन एएमएस को अलग करने में सफलता की दर कम है, और कुछ रिपोर्ट उपलब्ध हैं। महाधमनी कैनुलेशन की उचित गहराई भी तापमान, एंजाइम गतिविधि, पीएच, और बफर तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली पानी की गुणवत्ता से अलग आदर्श वीएम उपज में एक आवश्यक कारक है। Langendorff विधि का सिद्धांत दिल के प्रतिगामी परफ्यूजन पर निर्भर करता है। परफ्यूजन पर, महाधमनी वाल्व बंद हो जाता है; इस प्रकार, परफ्यूसेट को कोरोनरी धमनियों में मजबूर किया जाता है, पोत शाखाओं के माध्यम से एंजाइम समाधान प्रदान करता है, और मायोकार्डियल ऊतक समान रूप से पच जाता है। इस तरह के परिसंचरण पैटर्न को प्राप्त करने के लिए, महाधमनी को कैनुलेशन और बंधाव के लिए पर्याप्त लंबाई आरक्षित करनी चाहिए, साथ ही कैनुला टिप को महाधमनी वाल्वों में प्रवेश नहीं करना चाहिए या सीए ऑस्टियम को अवरुद्ध नहीं करना चाहिए। इस प्रकार, यह अनुमान लगाना उचित है कि महाधमनी कैनुलेशन की गहराई भी एट्रिया परफ्यूजन से जुड़ी हुई है, जो एट्रिया की पाचन प्रभावकारिता और एएम की पैदावार को इसी तरह से प्रभावित करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने परिकल्पना की पुष्टि की, और सुझावों के साथ सेल उपज को अनुकूलित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम नीचे नोट किए गए हैं।

चरण 1.9 में, महाधमनी को बेहतर ढंग से सुरक्षित करने के लिए, एक पायदान (या एक परिधीय नाली) के साथ एक कुंद 20 जी कैनुला जहां से टिप तक की दूरी 1 मिमी है, की सिफारिश की जाती है। हमारे अनुभवों के आधार पर, कैनुला आकार जो महाधमनी के व्यास से थोड़ा बड़ा है, कैनुला टिप को कैनुलेशन के दौरान महाधमनी वाल्वों को पंक्चर करने से रोकने के लिए पाया गया था क्योंकि महाधमनी, इसकी आंतरिक लोच पर निर्भर करते हुए, कैनुला में फिट हो सकती है और घर्षण पैदा कर सकती है, जो कैनुलेशन गहराई को समायोजित करते हुए आगे या पीछे की ओर बढ़ते समय एक सुरक्षात्मक कारक के रूप में कार्य करती है। पायदान की स्थिति के संदर्भ में, गुरुत्वाकर्षण के कारण कैनुलेशन के दौरान दिल आसानी से फिसल जाएगा यदि यह कैनुला टिप के पास बहुत करीब है। इसके विपरीत, कैनुलेशन गहराई और बंधाव की स्थिति को समायोजित करने के लिए स्थान बहुत दूर होने पर बहुत सीमित होगा। इन परिस्थितियों को देखते हुए, बाएं आम कैरोटिड धमनी ( चित्र2 में हरी रेखा के रूप में) के बीच महाधमनी को ट्रांसेक्ट करना यह सुनिश्चित करने के लिए कि महाधमनी काफी लंबी है और आरोही महाधमनी पर कैनुलेटेड और लिगेट किया जा सकता है, चरण 3.3 में बेहतर है। आरोही महाधमनी पर transacting जबकि, cannulation के लिए आरक्षित लंबाई कम से कम महाधमनी जड़ के करीब cannula टिप सुरक्षित कर सकता है और बंधाव के बाद महाधमनी वाल्व में प्रवेश नहीं होगा। महाधमनी की शारीरिक रचना और कैनुला टिप से सीए ऑस्टियम तक की दूरी का माप इंगित करता है कि बाएं आम कैरोटिड धमनी के बीच महाधमनी को ट्रांसेक्ट करना एक उचित महाधमनी कैनुलेशन गहराई प्राप्त करने के लिए एक आदर्श स्थिति है।

कैनुलेशन गहराई को एट्रिया के परफ्यूजन से जुड़ा हुआ पाया गया था, जो बदले में गहराई संकेतक के रूप में कार्य करता है। चित्रा 4 से पता चलता है कि एट्रिया परफ्यूजन अच्छा होता है जब गहराई आरोही महाधमनी पर होती है, और दोनों अलिंद उपांग फुलाए जाते हैं। हालांकि, एट्रिया परफ्यूजन अपर्याप्त है जब गहराई महाधमनी जड़ पर होती है (या निकट आती है) और दोनों अलिंद उपांग ों को विज़ेन किया जाता है। फुलाए गए अलिंद उपांगों से प्राप्त एएम की कुल और व्यवहार्य गिनती अधिक थी (चित्रा 8)। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि महाधमनी कैनुलेशन गहराई एक निश्चित तरीके से एट्रिया और एट्रियल उपांगों के परफ्यूजन और पाचन को प्रभावित कर सकती है और अंत में एएम उपज और गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। एएम की उपज और गुणवत्ता को उन जहाजों के वितरण से जुड़े होने का अनुमान लगाया गया था जो एट्रिया की आपूर्ति करते हैं। फर्नांडेज़ एट ^अल.23 के अध्ययन ने माउस सीए की उत्पत्ति और पाठ्यक्रम में विभिन्न विसंगतियों का प्रदर्शन किया है। उन्होंने पाया कि सीए ओस्टिया अत्यधिक परिवर्तनशील थे और सभी महाधमनी साइनस में स्थित नहीं थे। कुछ सीए महाधमनी साइनस के ऊपर से असंगत रूप से उत्पन्न हो सकते हैं, जिसे उच्च टेक-ऑफ ओस्टियम कहा जाता है। कुछ सीए एक ही महाधमनी साइनस से उत्पन्न हो सकते हैं, और एट्रियम पोत का ओस्टियम बस पास में है। वर्तमान अध्ययन (चित्रा 10) में महाधमनी की शारीरिक रचना भी फर्नांडेज़ की खोज के अनुरूप है। यह कारण हो सकता है कि लैंगेनडोर्फ विधि द्वारा एएम को अलग करने का प्रयास काफी हद तक असफल रहा है यदि कैनुलेशन गहराई उचित नहीं है। इस प्रकार, कैनुला टिप में एट्रियम पोत ओस्टियम को अवरुद्ध करने का एक बड़ा मौका होगा जो सीए ओस्टियम से सटे हुए हैं यदि कैनुला टिप और सीए ओस्टियम के बीच पर्याप्त स्थान उपलब्ध नहीं है। इसके विपरीत, वेंट्रिकल के परफ्यूजन और सेल उपज शायद ही कभी प्रभावित होते थे जब तक कि महाधमनी वाल्व कैनुला टिप द्वारा प्रवेश नहीं किए गए थे। यह शायद इसलिए है क्योंकि वेंट्रिकल को रक्त की आपूर्ति करने वाले सीए में बड़ा ओस्टिया और अधिक मूल होता है। यदि एक ओस्टियम को कैनुला द्वारा रोक दिया गया था, तो वेंट्रिकल परफ्यूजन को दूसरे सीए या संपार्श्विक परिसंचरण द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है, जबकि एट्रियम की आपूर्ति करने वाली रक्त वाहिका बल्कि छोटी होती है और इसका कोई विकल्प नहीं होता है। इस प्रकार, महाधमनी कैनुलेशन में गहराई का प्रभाव महत्वपूर्ण है।

पाचन और सेल भंडारण प्रक्रिया में अन्य उल्लेखनीय कारकों और परेशानी की शूटिंग को निम्नानुसार सूचीबद्ध किया गया है। सबसे पहले, मांसपेशियों के अनुबंध को बनाने के लिए चरण 4.1 में ऑक्सीजनयुक्त टायरोड के समाधान को परफ्यूज करने पर विचार करें और अवशिष्ट रक्त को पंप करें यदि एट्रिया में रक्त को महाधमनी बंधाव के बाद बाहर नहीं निकाला गया है। यह क्षतिग्रस्त एरिथ्रोसाइट्स से जारी सीए ^{2 +} और अन्य सामग्रियों के प्रतिकूल प्रभाव से बचने में मदद कर सकता है। दूसरा, कनेक्शन को अलग करने और कोशिकाओं के बीच की जगह का विस्तार करने के लिए समय से पहले सीए ^{2 +} मुक्त समाधान को परफ्यूज करना एंजाइम पाचन की प्रभावकारिता में सुधार कर सकता है क्योंकि सीएम के बीच इंटरकैलेटेड डिस्क कैल्शियम-निर्भर इंटरसेलुलर जंक्शन हैं। हालांकि, कैल्शियम विरोधाभास घटना ²⁴ से बचने के लिए समय को 3-5 मिनट तक सीमित किया जाना चाहिए। एक मिश्रित एंजाइम समाधान की सिफारिश की जाती है। कोलेजेनेज प्रकार II बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स नेटवर्क को बाधित करता है, और ट्रिप्सिन दानेदार सामग्री को साफ करने में मदद करता है जो सेल की सतह पर रहता है यदि कोलेजेनेस II पाचन अधूरा है। यह एक चिकनी सेल सतह सुनिश्चित करता है, जो पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग में एक GΩ सील बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। फिर भी, ट्रिप्सिन एकाग्रता को पाचन और कोशिका की चोट से बचने के लिए उचित सीमा में नियंत्रित किया जाना चाहिए क्योंकि यह झिल्ली प्रोटीन को नीचा दिखा सकता है। सेल उपज में सुधार करने के लिए अकेले कोलेजेनेस टाइप II का उपयोग करने से अक्सर पाचन पर ऊतक हो सकता है, और अलग-थलग सीएम लंबे समय तक कोलेजेनेस एक्सपोजर ²⁵ के बाद कैल्शियम असहिष्णु होंगे। 2,3-butanedione monoxime (BDM) का उपयोग, एक पदार्थ जो मायोसिन ATPase को बाधित करके और क्रॉस-ब्रिज गठन को रोककर सहज संकुचन को रोकता है, अभी भी विवादास्पद ^{है26,27,28,29}। पिछले अनुभव के अनुसार, इस प्रोटोकॉल के लिए BDM जोड़ना आवश्यक है। एंजाइम समाधान 1 के साथ तैयार किया जाता है, हालांकि समाधान 1 में कैल्शियम नहीं होता है, और एंजाइम को सक्रिय करने के लिए कैल्शियम जोड़ा जाता है। परफ्यूजन समाधान में बीडीएम जोड़ने के लाभ में (1) मायोसाइट्स संकुचन को रोकना और एंजाइम समाधान परफ्यूजन के दौरान ऑक्सीजन की खपत को कम करना और (2) हाइपोक्सिया से मायोसाइट्स को रोकना और पृथक मायोसाइट्स की गुणवत्ता में सुधार करना शामिल है। कुछ अध्ययनों ने बताया कि बीडीएम का सेलुलर विद्युत गुणों पर संभावित प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, सोडियम वर्तमान के पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के परिणामों ने अवांछनीय प्रभाव का संकेत नहीं दिया। सेल भंडारण चरण (चरण 6) में, कई अध्ययनों ने केबी बफर को चुना है, एक कैल्शियम मुक्त लेकिन उच्च पोटेशियम एकाग्रता समाधान, जिसमें कोशिकाएं बेहतर स्थिति बनाए रख सकती हैं क्योंकि वे ध्रुवीकृत और कम चयापचय स्थितियों में हैं। हालांकि, सेल झिल्ली का ग्लाइकोकैलिक्स एक निश्चित लंबाई के लिए बहिर्जात कैल्शियम की अनुपस्थिति में लिपिड बाईलेयर से अलग हो जाएगा और झिल्ली पारगम्यता बढ़ जाएगी, जो बाद के कार्यात्मक विश्लेषण ^30,31,32 को प्रभावित करेगी।

सभी मायोसाइट्स अलगाव तकनीकों को अनिवार्य रूप से वर्तमान में या तो भाग (ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा) में वर्गीकृत किया जा सकता है, जो एंजाइमेटिक समाधान में पाचन या एंजाइमेटिक समाधान (लैंगेनडॉर्फ परफ्यूजन) के साथ सीए परफ्यूजन (लैंगेनडॉर्फ परफ्यूजन) ²² है। Langendorff विधि के साथ तुलना में, हिस्सा पाचन विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और यह भी नियमित रूप से कई प्रयोगशालाओं में सीएम को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। हालांकि, यह विधि आमतौर पर वयस्क ऊतकों से खराब गुणवत्ता वाले सीएम की कम उपज का उत्पादन करती ^है22। इसके अलावा, इस विधि द्वारा अलग-थलग की गई कोशिकाएं तुलनात्मक प्रयोगों के संचालन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, एएम और वीएम के बीच सेल प्रकार-विशिष्ट दवा प्रभावों का परीक्षण करते समय, विभिन्न अलगाव स्थितियों के प्रभाव को उपेक्षित या बाहर नहीं किया जा सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि मायोकार्डियम और वेंट्रिकल का ऊतक घनत्व एट्रियम की तुलना में बहुत मोटा और सघन होता है, जिसके परिणामस्वरूप अलग-अलग पाचन समय और एंजाइम सांद्रता होती है। इसके अलावा, पाचन के दौरान ऊतक के अत्यधिक आंदोलन और पिपेटिंग कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा और कार्यात्मक अध्ययनों को काफी प्रभावित करेगा। इसके अलावा, कई पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एएम कैल्शियम के लिए अधिक कमजोर हैं। हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल द्वारा अलग किए गए एएम ग्रेडिएंट कैल्शियम रीइंट्रोडक्शन के सहिष्णु हो सकते हैं शायद इसलिए कि ऊतक पाचन प्रक्रिया के अंत में टूटना आसान है। इस प्रकार, यांत्रिक क्षति कम है, जबकि कोशिकाओं को अधिक यांत्रिक नुकसान होगा क्योंकि चंक विधि के चरणों को बार-बार टूटने और केन्द्रापसारक की आवश्यकता होती है। हाल ही में, Ackers et ^al.33 ने व्यवहार्य कार्डियक मायोसाइट्स और नॉनमायोसाइट्स के अलगाव के लिए एक सरलीकृत, लैंगेनडॉर्फ-मुक्त विधि की सूचना दी। वीएम और फाइब्रोब्लास्ट्स को प्रभावी ढंग से अलग किया जा सकता है, लेकिन एएम की मात्रा का उल्लेख नहीं किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, हृदय रक्त वाहिकाओं के वितरण में व्यक्तिगत मतभेदों और चूहों के तनाव के लिए भिन्नताएं हो सकती हैं, और अनुशंसित कैनुलेशन गहराई हर बार के लिए एक सफल एएम अलगाव की गारंटी नहीं दे सकती है। दूसरा, उन लोगों के लिए जो इस प्रक्रिया के लिए नए हैं, महाधमनी ट्रांससेक्शन और प्रतिगामी महाधमनी कैनुलेशन का अभ्यास करने में एक निश्चित समय लग सकता है। अंत में, इस विधि को स्वस्थ और बुजुर्ग चूहों को छोड़कर अन्य हृदय रोग मॉडल में परीक्षण नहीं किया गया था। इसलिए, इसे हृदय की फाइब्रोसिस सीमा के कारण एंजाइम सांद्रता और पाचन के समय में समायोजन की आवश्यकता होगी। चंक विधि में सामना की जाने वाली विभिन्न पाचन स्थितियों का नुकसान लैंगेनडॉर्फ विधि में एक समस्या नहीं होगी जिसमें एंजाइम समाधान समान रूप से पोत बिस्तरों द्वारा ऊतक को वितरित किया जाता है।

संक्षेप में, यहां वर्णित एकल एएम और वीएम के एक साथ अलगाव के लिए प्रोटोकॉल ने दिखाया है कि उचित महाधमनी कैनुलेशन गहराई प्रभावी रूप से आलिंद परफ्यूजन और एएम उपज में सुधार कर सकती है। इस विधि द्वारा अलग किए गए सीएम उच्च गुणवत्ता के हैं, अच्छे कैल्शियम सहिष्णुता के अधिकारी हैं, और टीम ³⁴ में पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग और कैल्शियम हैंडलिंग (^{Ca2 +} रिलीज और IonOptix सिस्टम द्वारा ^{Ca2 +} तरंग माप) पर सफलतापूर्वक लागू किए गए हैं। यह अनुमान लगाया जाता है कि अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग सेलुलर और उपकोशिकीय जांच की एक श्रृंखला में सेल की तैयारी के लिए किया जा सकता है, जो कार्डियक फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी की समझ को गहरा करने में मदद करेगा। महत्वपूर्ण रूप से, यह अधिक नैदानिक रूप से प्रासंगिक हृदय रोग तंत्र और हस्तक्षेप विधियों की खोज को सक्षम करेगा।

Materials

2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)