Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

Summary

Questo protocollo descrive le modifiche del metodo Langendorff, compresa la profondità della cannulazione dell’aorta per l’isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti.

Abstract

Un singolo cardiomiocita è uno strumento vitale negli studi a livello cellulare e subcellulare della biologia cardiaca e delle malattie come unità fondamentale di contrazione e attività elettrica. Quindi, isolare cardiomiociti vitali e di alta qualità dal cuore è la fase sperimentale iniziale e più cruciale. Confrontando i vari protocolli per isolare i cardiomiociti di topi adulti, la perfusione retrograda di Langendorff è il metodo più efficace e riproducibile riportato in letteratura, in particolare per isolare i miociti ventricolari. Tuttavia, isolare i miociti atriali di qualità dal cuore perfuso rimane difficile e sono disponibili pochi rapporti di isolamento di successo. Risolvere questo complicato problema è estremamente importante perché, a parte la malattia ventricolare, la malattia atriale rappresenta gran parte delle malattie cardiache. Pertanto, ulteriori indagini a livello cellulare per rivelare i meccanismi sono giustificate. In questo articolo, viene introdotto un protocollo basato sul metodo di perfusione retrograda di Langendorff e sono state apportate contemporaneamente alcune modifiche nella profondità della cannulazione dell’aorta e le fasi che possono influenzare il processo di digestione per isolare i miociti atriali e ventricolari. Inoltre, i cardiomiociti isolati sono confermati suscettibili di indagine patch clamp.

Introduction

Le malattie cardiache sono una delle principali cause globali di ^mortalità1. Per affrontare questo onere per il sistema sanitario, è essenziale una comprensione approfondita della fisiologia e della patologia del cuore. Oltre alla preparazione dell’intero animale e del cuore intatto, la preparazione cellulare è un altro strumento indispensabile per lo studio funzionale e della ^malattia2. Applicando il patch clamp, l’imaging del calcio, la biologia molecolare e altre tecnologie avanzate, i ricercatori possono ottenere maggiori informazioni sulle proprietà elettrofisiologiche, l’omeostasi del calcio, le vie di segnalazione, gli stati metabolici e le trascrizioni geniche in un singolo cardiomiocita (CM). Questo è estremamente utile per rivelare i meccanismi fisiologici e patologici del processo della malattia cardiaca3,4,5,6,7. Per la ricerca sugli animali, possono essere utilizzate specie che vanno da piccoli (ad esempio, topi, ratti e porcellini d’India) a animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e cani). Di solito si preferiscono i piccoli animali, in particolare i topi, perché sono suscettibili di manipolazione genetica e di modelli di malattia8,9,10.

Le tecniche di CM acutamente isolate hanno subito un lungo periodo di sviluppo e sono ancora in ^evoluzione11. La perfusione retrograda di Langendorff è il metodo di isolamento delle CM più efficace e riproducibile applicato nei ratti e nei topi, in particolare per l’isolamento dei miociti ventricolari (VM)12,13,14,15. Tuttavia, le segnalazioni di miociti atriali isolati con successo (AM) sono scarse16,17,18. Ulteriori indagini su entrambi i livelli dell’intero organo/sistema e cellulare/subcellulare per rivelare i meccanismi ed esplorare nuovi approcci terapeutici sono giustificate perché la fibrillazione atriale (FA), il tipo più comune di aritmia, sta diventando sempre più prevalente a livello globale e le attuali modalità di trattamento sia nelle terapie farmacologiche che nell’ablazione cardiaca rimangono inefficaci in circa il 40%-50% dei pazienti con fibrillazione ^atriale19 . L’isolamento di CM di topi adulti di successo è il primo passo per lo studio cellulare. È possibile utilizzare due metodi di isolamento primari: i metodi chunk e Langendorff. Nel metodo di perfusione di Langendorff, la digestione dei tessuti dipende dalla soluzione enzimatica erogata dalle arterie coronarie e dai loro rami ai letti capillari. Una corretta profondità di cannulazione dell’aorta che possa evitare di penetrare nelle valvole aortiche e bloccare l’ostia coronarica è il prerequisito per raggiungere un tale modello di perfusione, che è anche il passo essenziale per una digestione efficiente e una resa VM ideale. Quindi, è ragionevole supporre che la profondità della cannulazione dell’aorta possa influenzare in modo simile la perfusione del vaso degli atri e infine influenzare la resa AM. Per verificare questa ipotesi, è stata eseguita la cannulazione dell’aorta a diverse profondità e sono stati confrontati i corrispondenti rendimenti AM. I dati hanno mostrato che la profondità di cannulazione dell’aorta è direttamente rilevante per la resa AM. In questo contesto viene introdotto un protocollo per isolare contemporaneamente AM e VM.

Protocol

Topi maschi adulti C57BL / 6 del peso di 20-30 g, 8-10 settimane di età sono stati acquistati presso l’Animal Centre della Capital Medical University, Pechino, Cina. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall’Animal Care and Use Committee della Capital Medical University e sono state eseguite in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio proposta dall’Institute of Animal Resources e pubblicata dal National Institutes of Health. Excel e Origin 8.5 sono stati utilizzati per l’acquisizione e l’analisi dei dati. I dati sono presentati come mezzi ± SD, per la valutazione statistica, è stato utilizzato il test t dello studente e P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. 1. Preparazione della soluzione e dell’apparato di perfusione Assemblare un apparecchio Langendorff a flusso costante (disponibile in commercio o autoprodotto). Nella Figura 1 viene fornito uno schema semplice. Preparare le soluzioni secondo i reagenti indicati nelle Tabelle 1 e Tabella 2. Accendere il bagno d’acqua circolante e regolare una temperatura di ingresso adeguata (42,7 °C nel nostro laboratorio) per garantire che il deflusso del sistema di circolazione perfusata dalla cannula raggiunga i 37 °C. Pulire il sistema di perfusione facendo circolare acqua deionizzata. Se è richiesta una condizione sterile, eseguire il 75% di etanolo attraverso il sistema di perfusione per 15 minuti, seguito da acqua deionizzata (almeno 10 cicli per evitare effetti di tossicità da alcol sul cuore). Misurare il tempo e il volume per un ciclo del sistema di circolazione perfusato per determinare quanti millilitri di soluzione di Tyrode ossigenata da caricare nella successiva fase di perfusione. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici nel metodo desiderato. Impostare la portata del sistema di perfusione perfusato a 4 ml/min. Preparare due piastre di Petri pulite da 35 mm, una contenente la soluzione di Tyrode (capsula di Petri 1), l’altra contenente la soluzione 1 (capsula di Petri 2). Preparare una siringa da 1 mL riempita con soluzione 1 e un ago per cannula smussata in acciaio da 20 G con una tacca da cui la distanza è di 1 mm dalla punta. Preparare un nodo sciolto con sutura 3-0 all’albero della cannula. Regolare il campo visivo dello stereomicroscopio e assicurarsi che la punta della cannula sia al di sotto della superficie liquida della capsula di Petri 2. 2. Preparazione degli animali Somministrare eparina (concentrazione, 1.000 UI/mL; 0,2 ml/topo) per via intraperitoneale ai topi per evitare coaguli di sangue. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con pentobarbital di sodio (50 mg / kg, iniezione I.P.) e assicurarsi che i topi smettano di rispondere ai pizzichi della coda / dito. Eseguire la lussazione cervicale 20 minuti dopo la somministrazione di eparina. Trasferire i topi sulla piattaforma chirurgica, fissare i topi in posizione supina, sterilizzare il torace con etanolo al 75% e asciugarlo con una garza o un tovagliolo. 3. Escissione cardiaca e cannulazione dell’aorta Sollevare la pelle dello xifoide con una pinza tissutale e fare una piccola incisione laterale attraverso la pelle con le forbici del tessuto. Eseguire una dissezione smussata tra la pelle e la fascia ed estendere l’incisione della pelle a forma di V verso le ascelle su entrambi i lati. Continuare la stessa traccia di incisione attraverso la gabbia toracica, quindi deviare la gabbia toracica verso l’alto bloccando lo sterno con una pinza tissutale per esporre completamente il cuore e i polmoni. Staccare il pericardio usando una pinza curva. Strappare la ghiandola del timo verso entrambi i lati da due pinze curve se copre i grandi vasi. Tirare delicatamente la base del cuore verso la coda con una pinza curva fino a quando non si può vedere un vaso sanguigno a forma di “Y” (l’aorta e le sue arterie ramificate). Per riservare diverse lunghezze dell’aorta per la cannulazione e il confronto, transettare l’aorta nell’arteria carotide comune sinistra (linea verde nella Figura 2) e tagliare l’arteria brachiocefalica allo stesso tempo in alcuni topi. Transetto all’aorta ascendente in altri topi (linea nera in Figura 2).NOTA: Per coloro che sono nuovi a questa procedura, questo passaggio può essere eseguito anche al microscopio stereoscopico. Asportare il cuore e immergere immediatamente nella capsula di Petri 1 per lavare e pompare fuori il sangue residuo. Trasferire il cuore alla capsula di Petri 2 e tagliare il tessuto in eccesso usando le forbici dell’iride fini, se necessario. Per coloro che sono nuovi a questa procedura, fare questo passaggio sotto lo stereomicroscopio per evitare di tagliare erroneamente l’aorta o altre strutture cardiache. Spingere la siringa per espellere le bolle d’aria prima della cannulazione dell’aorta. Eseguire la cannulazione retrograda dell’aorta con l’assistenza di due pinze di legatura diritte (mascelle lisce) sotto lo stereomicroscopio. Assicurarsi che l’intero processo di cannulazione sia sotto la superficie del liquido. Evitare di penetrare nelle valvole aortiche e regolare le profondità all’aorta ascendente (il topo che l’aorta è stata transettata all’arteria carotide comune sinistra) e alla radice aortica (il topo che l’aorta è stata transettata all’aorta ascendente), rispettivamente.NOTA: La profondità della cannulazione dell’aorta (indicata semplicemente come profondità) è definita qui come la posizione in cui la punta della cannula si trova nell’aorta o dove l’aorta è legata. Ligate l’aorta con la sutura pre-nodo 3-0 alla tacca della cannula. Premere delicatamente il contenuto della siringa per risciacquare il sangue residuo.NOTA: Il sangue lascerà le arterie coronarie ed effuserà dalle vene dorsali se la profondità è posizionata correttamente. Il cuore e le appendici atriali si espanderanno e diventeranno pallidi. Rimuovere e collegare la cannula all’apparato Langendorff. Ancora una volta, fai attenzione a evitare che eventuali bolle d’aria entrino nel cuore.NOTA: Tenere presente che il tempo dalla toracotomia alla perfusione iniziale non deve superare i 5 minuti. 4. Perfusione cardiaca In primo luogo, innescare e perfondere la soluzione di Tyrode ossigenata per circa 10 s (il volume di liquido che corre 10 s nel sistema utilizzato in questo protocollo è di circa 0,7 ml) se c’è sangue residuo negli atri, quindi passare alla soluzione 1. Tuttavia, basta perfondere con la soluzione 1 Se non c’è sangue residuo negli atri. Perfondi il cuore per circa 2 min. Passare alla soluzione 3. Aspirare circa 2,5 ml di soluzione 3 con un pipetto sterile in polietilene monouso e preriscaldarlo a bagnomaria per un uso successivo, mentre il resto utilizzato per la perfusione per circa 11-12 minuti. Scartare la soluzione 3 perfusa nei primi 2 minuti. Riciclare il resto nei serbatoi di perfusato dalla pompa peristaltica per il riutilizzo fino al completamento della digestione. Terminare la digestione quando il cuore si gonfia e diventa leggermente pallido e flaccido (consistenza spugnosa) o esiste un’impronta se il miocardio viene pizzicato delicatamente usando una pinza dentata. 5. Isolamento cellulare e reintroduzione del calcio Rimuovere i ventricoli e gli atri con una pinza e metterli in diverse piastre di Petri. Aggiungere la soluzione preriscaldata 3 alle piastre di Petri. Triturare il tessuto in una consistenza torbida con pinza smussata e pipettare delicatamente il tessuto per una digestione uniforme. Evitare di introdurre bolle d’aria. Trasferire il tessuto torbido digerito con la pipetta nella soluzione 4 per arrestare l’attività enzimatica rimanente, quindi centrifugare per 20 s a 192×g. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione 5 nel sedimento cellulare e nella pipetta per disperdere uniformemente le cellule. Reintrodurre il calcio in modo graduale al fine di evitare il paradosso del calcio e il sovraccarico di calcio. Aggiungere gradualmente un totale di 50 μL 100 mM/L CaCl2 (ad ogni intervallo di 5 minuti di 5 μL, 10 μL, 15 μL e 20 μL, rispettivamente) alla sospensione cellulare. 6. Archiviazione delle celle Per lo studio del morsetto patch, conservare le cellule nella soluzione di Tyrode. Per altri studi cellulari, conservare le cellule nella soluzione 6. Per garantire l’accuratezza dei risultati degli studi funzionali acuti (ad esempio, scintille Ca2 +, onde Ca2+ , rilascio Ca2+ , perdite Ca2+ e registrazioni patch clamp), terminare questo tipo di esperimenti funzionali entro le prossime 6 ore.

Representative Results

Questa carta, in cui la punta della cannula è posizionata nell’aorta, che è definita come la profondità della cannulazione dell’aorta (indicata semplicemente come profondità), rappresenta anche dove l’aorta è legata. L’AM e il VM isolati da un cuore che è stato cannulato e legato all’aorta ascendente sono rappresentati rispettivamente come AMAA e VMAA. Inoltre, AM e VM isolati da un cuore che è stato cannulato e legato alla radice aortica sono rappresentati rispettivamente come AMAR e VMAR. La Figura 2 mostra la panoramica dell’aorta e delle posizioni di trasezione. Inoltre, la Figura 3 mostra le profondità e i punti di legatura che corrispondono alle posizioni di transezione dell’aorta. La profondità era associata alla perfusione degli atri e delle appendici atriali. Entrambe le appendici atriali sono gonfiate quando la punta della cannula si trova all’aorta ascendente, indicando una sufficiente perfusione degli atri. Tuttavia, quando alla radice aortica, la perfusione degli atri è insufficiente ed entrambe le appendici atriali sono avvizzite (Figura 4). La morfologia e la vitalità della CM che vengono isolate dai cuori cannulati a diverse profondità dopo la reintroduzione del calcio (Figura 5). Le morfologie cellulari di AMAA, AMAR, VMAA e VMAR sono sotto il microscopio confocale prima e dopo la reintroduzione del calcio. Gli AM sono a forma di mandrino, mentre le VM sono a forma di asta con estremità rettangolari. Inoltre, gli AM e i VM hanno membrane intatte, contorni chiari, sarcomeri striati chiari e superficie liscia (Figura 6). La vitalità cellulare è stata valutata tramite colorazione blu tripano. Le cellule normali con membrane intatte possono escludere il tripano blu e non saranno macchiate, mentre l’attività di perdita delle cellule accumulerà rapidamente il blu di tripano intracellulare (Figura 7). Gli AM e le VM sono stati posizionati in diverse diapositive di oggetti per eseguire il conteggio delle celle. Le rese totali di AM e la percentuale di CM vitali a forma di fuso (tasso di sopravvivenza) sono state determinate trasferendo 10 μL della sospensione cellulare su un vetrino di oggetti e contate sotto un microscopio a contrasto di fase invertito a 4 × 10 campi visivi. Lo stesso metodo è stato utilizzato per determinare i rendimenti totali delle VM (a forma di asta) e la percentuale di VM valide. Questo metodo è preferito rispetto all’utilizzo di un emocitometro, perché i CM non si sono facilmente distribuiti nell’area di conteggio dell’emocitometro a causa delle loro dimensioni e forma. Un grafico a barre (Figura 8) mostra i tassi di sopravvivenza di AMAA, AMAR, VMAA e VMAR prima e dopo la reintroduzione del calcio. Ogni valore rappresenta la media ± SD da 10 topi. Prima della reintroduzione del calcio, i tassi di sopravvivenza di AMAA sono significativamente più alti di quelli di AMAR (70,9% ± 2,8% e 41,0% ± 5,2%, rispettivamente; p < 0,01). Dopo la reintroduzione del calcio, i tassi di sopravvivenza di AMAA sono significativamente più alti di quelli di AMAR (69,4% ± 3,0% e 37,7% ± 4,9%, rispettivamente; p < 0,01). I tassi di sopravvivenza al VMAA non differivano da quelli del VMAR (89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± 2,6%, rispettivamente; p > 0,05) prima della reintroduzione del calcio. Allo stesso modo, i tassi di sopravvivenza al VMAA non differivano da quelli del VMAR (82,2% ± 1,9% vs 82,9% ± 1,6%, rispettivamente; p > 0,05) dopo la reintroduzione del calcio. Un cuore cannulato in profondità come raccomandato da questo protocollo (all’aorta ascendente), una resa di VM e AM praticabile di circa 4,1 milioni e circa 180.000, rispettivamente, dopo la reintroduzione del calcio. La registrazione del morsetto patch a cellula intera della corrente di sodio (Figura 9A, B) e delle densità di corrente (Figura 9C) nell’AM e nel VM isolati conferma che la qualità della cella ha soddisfatto i requisiti per gli esperimenti elettrofisiologici. L’anatomia dell’aorta (Figura 10) mostra che l’ostio del vaso atriale è vicino alla radice aortica ed è adiacente all’ostio dell’arteria coronaria (CA). La tabella 3 mostra la distanza dalla punta della cannula all’ostio CA dei cuori cannulati e legati rispettivamente all’aorta ascendente e alla radice aortica. Figura 1. Diagramma schematico di un sistema Langendorff modificato assemblato. Questo sistema è economico e portatile per gli utenti. Ha due parti di tubo di plastica – una per l’acqua (diametro interno, 8 mm) e una per il perfusato (diametro interno, 1,5 mm) – di cui l’estremità distale è collegata a un rubinetto a tre vie medico pe con una serratura Luer. Una bottiglia di vetro contenente acqua e con un tappo di gomma forma come scambiatore di calore. Il perfusato viene pompato nel tubo di plastica nello scambiatore di calore dalla pompa peristaltica ed esce dal rubinetto a tre vie collegato alla cannula. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Aorta e tessuti intorno. Una struttura dei vasi sanguigni a forma di “Y” è l’aorta e i suoi rami: l’arteria brachiocefalica (freccia 1) e l’arteria carotide comune sinistra (freccia 2). Transecare l’aorta tra l’arteria carotide comune sinistra (linea verde) e contemporaneamente tagliare l’arteria brachiocefalica in alcuni topi; transetto all’aorta ascendente (linea nera) in altri topi (stereomicroscopio 10 × 2 ingrandimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Vista frontale del cuore cannulato. La linea curva nera rappresenta il bordo incisale dell’aorta che è stato transetto tra l’arteria carotide comune sinistra. La linea curva rossa rappresenta il bordo incisivo dell’aorta transettata all’aorta ascendente. La linea retta rappresenta dove l’aorta è stata legata: nero all’aorta ascendente e rosso alla radice aortica (stereomicroscopio 10 × 2 ingrandimento). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4. Stato di perfusione dei cuori cannulati. Gli atri sono sufficientemente perfusi ed entrambe le appendici atriali sono gonfiate nel cuore (A) cannulato e legato all’aorta ascendente. Tuttavia, entrambe le appendici atriali sono avvizzite nel cuore (B) cannulate e legate alla radice aortica, indicando una scarsa perfusione degli atri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5. Valutazione della morfologia cellulare e della vitalità dopo reintroduzione del calcio. Gli AM (A) e i VM (B) isolati dal cuore cannulati e legati all’aorta ascendente sono rappresentati rispettivamente come AMAA e VMAA. Gli AM (C) e i VM (D) isolati dal cuore cannulati e legati alla radice aortica sono rappresentati rispettivamente come AAR e VVAR. I CM di alta qualità sono quiescenti e hanno membrane intatte, contorni chiari, sarcomeri striati chiari e una superficie cellulare liscia. Gli AM sono a forma di mandrino, mentre le VM sono a forma di asta o di mattone con estremità rettangolari. I CM che si contraggono spontaneamente o contengono bub nella membrana sono di scarsa qualità e quelli che si restringono in una forma sferica sono cellule morte. Un campo visivo casuale (microscopio a fluorescenza, ingrandimento 10 × 10; barre di scala, 100 μm). AM = miocita atriale, VM = miocita ventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6. Morfologia cellulare al microscopio confocale prima e dopo la reintroduzione del calcio. Prima della reintroduzione del calcio, AMAA (A) e AMAR (C) sono a forma di fuso con contorni chiari, sarcomeri striati e superfici di membrana lisce. Dopo la reintroduzione del calcio, AMAA (B) e AMAR (D) sono anche a forma di fuso con contorni chiari, sarcomeri striati e superfici di membrana lisce. Prima della reintroduzione del calcio, VMAA (E) e VMAR (G) sono a forma di asta o mattone con contorni chiari, sarcomeri striati e superfici di membrana lisce con estremità rettangolari. Dopo la reintroduzione del calcio, VMAA (F) e VMAR (H) sono anche a forma di asta o mattone con contorni chiari, sarcomeri striati e superfici di membrana lisce con estremità rettangolari (olio per microscopio confocale, ingrandimento 63 × 10; barre di scala, 50 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7. Valutazione della vitalità cellulare. Le cellule danneggiate che perdono attività sono macchiate dal tripano blu. Al contrario, le cellule vitali non possono essere macchiate dal tripano blu (microscopio a fluorescenza, ingrandimento 4 × 10; barre di scala, 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8. Grafico a barre che mostra i tassi di sopravvivenza di AMAA, AMAR, VMAA e VMAR prima e dopo la reintroduzione del calcio. CR = reintroduzione del calcio. Ogni valore rappresenta la media ± SD da 10 topi. p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Soluzione Contenuto (concentrazione finale in mmol/L, se non diversamente specificato) rinomato Soluzione di perfusione (soluzione 1) 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurina, 5 Glucosio, 10 2,3-butandione monoxima (BDM) Che può essere conservato per 3 giorni a 4 °C. Glucosio, taurina e BDM vengono aggiunti il giorno dell’esperimento. Preparare 200 ml di soluzione di perfusione per ogni cuore. Soluzione di Tyrode (soluzione 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glucosio Che può essere conservato per 3 giorni a 4 °C. CaCl2 e glucosio vengono aggiunti il giorno dell’esperimento, regolano il pH a 7,3-7,4 con NaOH saturo a temperatura ambiente (28-30 ° C) con un misuratore di PH. Tabella 1. Soluzioni per l’isolamento CM del topo adulto. Soluzione Contenuto rinomato Soluzione di digestione(soluzione 3) 25 mL soluzione 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg collagenasi II, 50μL (2,5 % 10×) tripsina per ogni cuore Arrestare la soluzione 1(soluzione 4) 9 mL soluzione 1, 1 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 per ogni cuore Soluzione di arresto 2 (soluzione 5) 9,5 mL soluzione 1, 0,5 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 per ogni cuore Soluzione di risospensione cellulare(soluzione 6) 13 mL soluzione 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) ad una dose che può formare uno strato sottile che copre la superficie del liquido per ogni cuore Tabella 2. Soluzioni per l’isolamento e lo stoccaggio di CM per topi adulti. Figura 9. Curve corrente-tensione dei canali del sodio. Sono state utilizzate tecniche di patch clamp a cellule intere per registrare le correnti di sodio dei cardiomiociti isolati nella modalità di clamp di tensione. Il protocollo del morsetto di tensione è mostrato nell’inserto. Vengono mostrate le correnti di sodio registrate dall’AM (A) e dal VM (B). Le densità di corrente a potenziali di -45mV, -40mV e -35 mV sono significativamente più elevate in AM (-32,71 ± 1,597 pA/pF, -31,49 ± 1,820 pA/pF e -29,34 ± 1,939 pA/pF, rispettivamente; n = 10) rispetto a VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, -21,09 ± 1,560 pA/pF e -21,86 ± 1,381 pA/pF, rispettivamente; n = 8; P < 0,05). (C) Le curve I-V mostrano le densità di corrente di sodio che sono state normalizzate alla capacità cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10. Origine e distribuzione della nave atriale. La nave atriale (freccia 1) e la CA (freccia 2) nel pannello A. Il pannello B è uno sguardo più da vicino al vaso atriale (freccia 3). (C) Esistono due ostie di dimensioni diverse; uno (freccia 4) corrisponde al vaso atriale che irrigava le appendici atriali, e l’altro (freccia 5) corrisponde al CA (stereomicroscopio 10 × 5 ingrandimento). CA = arteria coronaria. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Il numero di serie dei mouse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 La profondità della cannulazione dell’aorta è all’aorta ascendente 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 La profondità della cannulazione dell’aorta è alla radice aortica 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 Tabella 3. Distanza dalla punta della cannula all’ostio dell’arteria coronaria. I cuori dei topi C57BL/6 (n = 20) sono stati usati per cannulare e ligatare l’aorta a profondità dell’aorta ascendente e della radice aortica, rispettivamente. L’aorta è anatomizzata ed è stata misurata la distanza dalla punta della cannula all’ostio CA. La distanza è misurata in millimetri e i segni positivi o negativi rappresentano rispettivamente la punta della cannula sopra e sotto l’ostio CA.

Discussion

La CM singola è uno strumento prezioso e indispensabile negli studi a livello cellulare della funzione cardiaca e delle ^malattie20. Quindi, l’isolamento dei CM vitali dai cuori è il passo iniziale e più cruciale. La qualità delle cellule è uno dei determinanti significativi per condurre esperimenti di successo, specialmente negli esperimenti ottici ed elettrofisiologici. Rispetto ai CM di altri animali, i CM dei roditori sono più vulnerabili all’ischemia e all’ipossia a causa di una maggiore concentrazione di ioni sodio intracellulari, che favorisce l’afflusso di calcio attraverso lo scambiatore Na⁺/^Ca2+21. Inoltre, il numero di AM è di gran lunga inferiore a quello delle VM; pertanto, l’isolamento di successo è estremamente difficile da raggiungere. Il metodo Langendorff è eccellente per isolare le VM dei ^topi22, ma il tasso di successo nell’isolamento degli AM è basso e sono disponibili pochi report. La corretta profondità della cannulazione dell’aorta è anche un fattore essenziale per produrre VM ideali oltre alla temperatura, all’attività enzimatica, al PH e alla qualità dell’acqua utilizzata per la preparazione del tampone. Il principio del metodo Langendorff si basa sulla perfusione retrograda del cuore. Alla perfusione, la valvola aortica è chiusa; in tal modo, il perfusato viene forzato nelle arterie coronarie, fornendo soluzione enzimatica attraverso i rami dei vasi e il tessuto miocardico viene digerito uniformemente. Per ottenere questo tipo di schema di circolazione, l’aorta deve riservare una lunghezza sufficiente per la cannulazione e la legatura, inoltre la punta della cannula non deve penetrare nelle valvole aortiche o bloccare l’ostio CA. Pertanto, è ragionevole ipotizzare che la profondità della cannulazione dell’aorta sia anche associata alla perfusione degli atri, che influenza l’efficacia digestiva degli atri e le rese di AM in modo simile. Il protocollo qui presentato ha confermato l’ipotesi e i passaggi cruciali per ottimizzare la resa cellulare insieme ai suggerimenti sono indicati di seguito.

Nel passaggio 1.9, per fissare meglio l’aorta, si consiglia una cannula smussata da 20 G con una tacca (o una scanalatura circonferenziale) da dove la distanza è di 1 mm dalla punta. Sulla base delle nostre esperienze, la dimensione della cannula che è un po ‘più grande del diametro dell’aorta è stata trovata per impedire alla punta della cannula di perforare le valvole aortiche durante la cannulazione perché l’aorta, facendo affidamento sulla sua elasticità intrinseca, può adattarsi perfettamente alla cannula e produrre attrito, che funge da fattore protettivo quando si sposta in avanti o indietro regolando la profondità della cannulazione. In termini di posizione della tacca, il cuore scivolerà facilmente durante la cannulazione a causa della gravità se è troppo vicino alla punta della cannula. Al contrario, lo spazio per regolare la profondità di cannulazione e la posizione di legatura sarà molto limitato se troppo lontano. Date queste circostanze, il transetto dell’aorta tra l’arteria carotide comune sinistra (come la linea verde nella Figura 2) per garantire che l’aorta sia abbastanza lunga e possa essere cannulata e legata all’aorta ascendente è migliore nel passaggio 3.3. Mentre il transetto all’aorta ascendente, la lunghezza riservata per la cannulazione almeno potrebbe fissare la punta della cannula vicino alla radice aortica e non penetrerà nelle valvole aortiche dopo la legatura. L’anatomia dell’aorta e la misurazione della distanza dalla punta della cannula all’ostio CA indicano che il transetto dell’aorta tra l’arteria carotide comune sinistra è una posizione ideale per ottenere una corretta profondità di cannulazione dell’aorta.

La profondità di cannulazione è risultata essere associata alla perfusione degli atri, che a sua volta funge da indicatore di profondità. La Figura 4 mostra che la perfusione degli atri è buona quando la profondità è all’aorta ascendente ed entrambe le appendici atriali sono gonfiate. Tuttavia, la perfusione degli atri è insufficiente quando la profondità è (o si avvicina) alla radice aortica ed entrambe le appendici atriali sono avvizzite. Il conteggio totale e vitale di AM prodotto dalle appendici atriali gonfiate era più alto (Figura 8). Questi risultati indicano che la profondità di cannulazione dell’aorta può influenzare la perfusione e la digestione degli atri e delle appendici atriali in un certo modo e infine influenzare la resa e la qualità dell’AM. La resa e la qualità dell’AM sono state dedotte come associate alla distribuzione delle navi che riforniscono gli atri. Lo studio di Fernández et ^al.23 ha dimostrato varie anomalie nell’origine e nel decorso della CA del topo. Hanno scoperto che le CA ostia erano altamente variabili e non erano tutte situate nel seno aortico. Alcune CA possono originarsi in modo anomalo da sopra i seni aortici, chiamati ostio ad alto decollo. Alcuni CA possono provenire dallo stesso seno aortico e l’ostio del vaso dell’atrio si trova proprio nelle vicinanze. L’anatomia dell’aorta nel presente studio (Figura 10) è anche coerente con la scoperta di Fernández. Questa potrebbe essere la causa per cui i tentativi di isolare AM con il metodo Langendorff sono stati in gran parte infruttuosi se la profondità di cannulazione non è appropriata. Pertanto, la punta della cannula avrà una maggiore possibilità di bloccare l’ostio del vaso dell’atrio adiacente all’ostio CA se non è disponibile abbastanza spazio tra la punta della cannula e l’ostio CA. Al contrario, la perfusione e la resa cellulare del ventricolo erano difficilmente influenzate finché le valvole aortiche non erano penetrate dalla punta della cannula. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che le CA che forniscono sangue al ventricolo hanno ostia più grande e più origini. Se un ostio è stato occluso dalla cannula, la perfusione del ventricolo può essere compensata da un’altra CA o dalla circolazione collaterale, mentre il vaso sanguigno che alimenta l’atrio è piuttosto piccolo e non ha sostituto. Pertanto, l’influenza della profondità nella cannulazione dell’aorta è importante.

Altri fattori degni di nota e la risoluzione dei problemi nel processo di digestione e conservazione delle cellule sono elencati come segue. In primo luogo, considerare di perfondere la soluzione di Tyrode ossigenata nel passaggio 4.1 per far contrarre il muscolo e pompare il sangue residuo se il sangue negli atri non è stato espulso dopo la legatura dell’aorta. Questo può aiutare a evitare l’effetto negativo di ^{ca2 +} e altri materiali rilasciati dagli eritrociti danneggiati. In secondo luogo, perfondere la soluzione ^ca2+-free in anticipo per dissociare la connessione ed espandere lo spazio tra le cellule può migliorare l’efficacia della digestione enzimatica perché i dischi intercalati tra i CM sono giunzioni intercellulari calcio-dipendenti. Tuttavia, il tempo dovrebbe essere limitato a 3-5 minuti per evitare il fenomeno del paradosso del ^calcio24. Si raccomanda una soluzione enzimatica mista. La collagenasi di tipo II interrompe la rete della matrice extracellulare e la tripsina aiuta a eliminare il materiale granulare che rimane sulla superficie cellulare se la digestione della collagenasi II è incompleta. Ciò garantisce una superficie cellulare liscia, che è fondamentale per formare una guarnizione GΩ nella registrazione del morsetto patch. Tuttavia, la concentrazione di tripsina deve essere controllata nel giusto intervallo per evitare la digestione eccessiva e lesioni cellulari perché può degradare la proteina di membrana. L’uso della sola collagenasi di tipo II per migliorare la resa cellulare può spesso portare a una digestione eccessiva dei tessuti e le CM isolate saranno intolleranti al calcio dopo un’esposizione prolungata alla ^{collagenasi25}. L’uso del 2,3-butandione monoxime (BDM), una sostanza che previene la contrazione spontanea inibendo la miosina ATPasi e prevenendo la formazione di ponti incrociati, è ancora controverso26,27,28,29. Secondo l’esperienza precedente, l’aggiunta di BDM è necessaria per questo protocollo. La soluzione enzimatica viene preparata con la soluzione 1 anche se la soluzione 1 non contiene calcio e il calcio viene aggiunto per attivare l’enzima. Il vantaggio di aggiungere BDM nella soluzione di perfusione include (1) inibire la contrazione dei miociti e ridurre il consumo di ossigeno durante la perfusione della soluzione enzimatica e (2) prevenire l’ipossia dei miociti e migliorare la qualità dei miociti isolati. Alcuni studi hanno riportato che il BDM può avere una potenziale influenza negativa sulle proprietà elettriche cellulari. Tuttavia, i risultati della registrazione del morsetto patch a cellula intera della corrente di sodio non hanno indicato un effetto indesiderato. Nella fase di conservazione cellulare (fase 6), numerosi studi hanno scelto il tampone KB, una soluzione priva di calcio ma ad alta concentrazione di potassio, in cui le cellule possono mantenere uno stato migliore perché si trovano in condizioni polarizzate e a bassa metabolica. Tuttavia, il glicocalice della membrana cellulare si separerà dal doppio strato lipidico in assenza di calcio esogeno per un certo periodo di tempo e la permeabilità della membrana aumenterà, influenzando la successiva analisi funzionale30,31,32.

Tutte le tecniche di isolamento dei miociti possono essere essenzialmente classificate attualmente in digestione a blocchi (un piccolo pezzo di tessuto) in una soluzione enzimatica o perfusione CA con soluzione enzimatica (la perfusione di Langendorff)²². Rispetto al metodo Langendorff, il metodo di digestione dei blocchi è più facile da eseguire ed è anche abitualmente utilizzato per isolare i CM in molti laboratori. Tuttavia, questo metodo produce normalmente una bassa resa di CM di scarsa qualità da tessuti ^adulti22. Inoltre, le cellule isolate con questo metodo potrebbero non essere adatte per condurre esperimenti comparativi. Ad esempio, quando si testano gli effetti farmacologici specifici del tipo di cellula tra AM e VM, l’impatto di diverse condizioni di isolamento non può essere trascurato o escluso. Questo perché il miocardio e la densità tissutale del ventricolo sono molto più spessi e densi di quelli dell’atrio, con conseguenti tempi di digestione e concentrazioni enzimatiche diversi. Inoltre, l’eccessiva agitazione e il pipettaggio del tessuto durante la digestione danneggeranno le cellule e avranno un impatto significativo sugli studi funzionali. Inoltre, molti studi precedenti hanno dimostrato che gli AM sono più vulnerabili al calcio. Tuttavia, gli AM isolati dal protocollo corrente possono essere tolleranti alla reintroduzione del calcio gradiente probabilmente perché il tessuto è facile da rompere alla fine del processo di digestione. Pertanto, il danno meccanico è inferiore, mentre le cellule subirebbero più danni meccanici poiché le fasi del metodo chunk richiedono una rottura ripetuta e centrifuga. Più recentemente, Ackers et ^al.33 hanno riportato un metodo semplificato, privo di Langendorff, per l’isolamento di miociti cardiaci vitali e non miociti. Le VM e i fibroblasti possono essere isolati in modo efficace, ma la quantità di AM non è stata menzionata. Tuttavia, questo protocollo presenta diverse limitazioni. In primo luogo, la distribuzione dei vasi sanguigni cardiaci può avere variazioni per le differenze individuali e il ceppo dei topi, e la profondità di cannulazione raccomandata non può garantire un isolamento AM di successo per ogni volta. In secondo luogo, per coloro che sono nuovi a questa procedura può richiedere una certa quantità di tempo per praticare la transezione dell’aorta e la cannulazione retrograda dell’aorta. Infine, questo metodo non è stato testato in altri modelli di malattie cardiache tranne che in topi sani e anziani. Quindi, richiederà aggiustamenti nelle concentrazioni enzimatiche e nel tempo di digestione a causa dell’estensione della fibrosi del cuore. Lo svantaggio delle diverse condizioni di digestione incontrate nel metodo chunk non sarà un problema nel metodo Langendorff in cui la soluzione enzimatica viene distribuita uniformemente al tessuto dai letti dei vasi.

In sintesi, i protocolli per l’isolamento simultaneo di singoli AM e VM qui descritti hanno dimostrato che la corretta profondità di cannulazione dell’aorta può migliorare efficacemente la perfusione dell’atrio e la resa AM. I CM isolati con questo metodo sono di alta qualità, possiedono una buona tolleranza al calcio e sono stati applicati con successo alla registrazione del patch clamp e alla gestione del calcio (rilascio di ^Ca2+ e misurazione dell’onda ^Ca2+ da parte del sistema IonOptix) nel ^team34. Si prevede che il protocollo di isolamento possa essere utilizzato per la preparazione cellulare in una serie di indagini cellulari e subcellulari, che aiuteranno ad approfondire la comprensione della fisiologia e della patologia cardiaca. È importante sottolineare che consentirà la scoperta di meccanismi e metodi di intervento clinicamente più rilevanti per le malattie cardiache.

Materials

2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)