Denne protokollen beskriver modifikasjoner av Langendorff-metoden, inkludert dybden av aortakannasjon for samtidig isolering av atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus.
En enkelt kardiomyocytt er et viktig verktøy i cellulære og subcellulære nivåstudier av hjertebiologi og sykdommer som en grunnleggende enhet for sammentrekning og elektrisk aktivitet. Derfor er det første og mest avgjørende eksperimentelle trinnet å isolere levedyktige kardiomyocytter av høy kvalitet fra hjertet. Sammenligning av de ulike protokollene for å isolere kardiomyocytter av voksne mus, langendorff retrograd perfusjon er den mest vellykkede og reproduserbare metoden rapportert i litteraturen, spesielt for å isolere ventrikulære myocytter. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å isolere kvalitetsatrie-myocytter fra det perfused hjertet, og få vellykkede isolasjonsrapporter er tilgjengelige. Å løse dette kompliserte problemet er ekstremt viktig fordi bortsett fra ventrikkelsykdom, står atriesykdom for en stor del av hjertesykdommer. Derfor er ytterligere undersøkelser på cellenivå for å avsløre mekanismene berettiget. I dette dokumentet innføres en protokoll basert på Langendorff retrograd perfusjonsmetode, og noen modifikasjoner i dybden av aortakanokulering og trinnene som kan påvirke fordøyelsesprosessen for å isolere atrie- og ventrikulære myocytter, ble samtidig gjort. Videre er de isolerte kardiomyocyttene bekreftet å være mottagelige for å lappe klemmeundersøkelse.
Hjertesykdom er en av de ledende globale årsakene til dødelighet1. For å møte denne byrden på helsevesenet er en grundig forståelse av hjertets fysiologi og patologi viktig. Foruten hele dyr og intakt hjerteforberedelse, er cellulær forberedelse et annet uunnværlig verktøy for funksjonell og sykdomsstudie2. Ved å bruke patchklemmen, kalsiumavbildning, molekylærbiologi og andre avanserte teknologier, kan forskere få mer informasjon om elektrofysiologiske egenskaper, kalsium homeostase, signalveier, metabolske tilstander og gentranskripsjoner i en enkelt kardiomyocytt (CM). Dette er ekstremt nyttig for å avsløre de fysiologiske og patologiske mekanismene i hjertesykdomsprosessen3,4,5,6,7. For dyreforskning kan arter som spenner fra små (f.eks. mus, rotter og marsvin) til store (f.eks. kaniner og hunder) dyr brukes. Små dyr er vanligvis foretrukket, spesielt mus, fordi de er mottagelige for genetisk og sykdomsmodellmanipulering8,9,10.
Teknikker for akutt isolerte CMs har gjennomgått en lang utviklingsperiode og utvikler seg fortsatt11. Langendorff retrograd perfusjon er den mest vellykkede og reproduserbare CMs isolasjonsmetoden som brukes hos rotter og mus, spesielt for å isolere ventrikulære myocytter (VMs)12,13,14,15. Rapporter om vellykket isolerte atrie-myocytter (AMs) er imidlertid knappe16,17,18. Videre undersøkelser av både nivåer av hele organet/systemet og cellulær/subcellulær for å avdekke mekanismene og utforske nye terapeutiske tilnærminger er berettiget fordi atrieflimmer (AF), den vanligste typen arytmi, i økende grad blir utbredt globalt, og dagens behandlingsmodaliteter i både farmakologiske terapier og hjerteablasjon forblir ineffektive hos omtrent 40% -50% av AF-pasientene19 . Vellykket CMs-isolasjon for voksne mus er det første trinnet for cellulær studie. To primære isolasjonsmetoder kan brukes: del- og Langendorff-metodene. I Langendorff perfusjonsmetoden avhenger vevsfordøyelsen av enzymoppløsningen som leveres av koronararteriene og deres grener til kapillære senger. En riktig aortakanouleringsdybde som kan unngå å trenge inn i aortaventilene og blokkere koronararterien ostia er forutsetningen for å oppnå et slikt perfusjonsmønster, som også er det essensielle trinnet for effektiv fordøyelse og ideelt VM-utbytte. Derfor er det rimelig å anta at aortakanokulasjonens dybde på samme måte kan påvirke atriafartøyets perfusjon og til slutt påvirke AM-utbyttet. For å teste denne hypotesen ble aortakanokulasjon på forskjellige dybder utført og de tilsvarende AM-utbyttene ble sammenlignet. Dataene viste at aortakanokulasjonsdybden er direkte relevant for AM-utbyttet. Heri introduseres en protokoll for å isolere AMs og virtuelle maskiner samtidig.
Single CM er et verdifullt og uunnværlig verktøy i cellulære studier av hjertefunksjon og sykdommer20. Derfor er isolasjonen av levedyktige CMs fra hjertene det første og mest avgjørende trinnet. Cellekvalitet er en av de betydelige determinantene for å utføre vellykkede eksperimenter, spesielt i optiske og elektrofysiologiske eksperimenter. Sammenlignet med CMs av andre dyr, gnager CMs er mer sårbare for iskemi og hypoksi på grunn av en høyere konsentrasjon av intracellulære natriumioner, som favoriserer kalsiumtilstrømning gjennom Na + / Ca2 + veksler21. Dessuten er antall AMs langt mindre enn for virtuelle maskiner; Dermed er vellykket isolasjon ekstremt vanskelig å oppnå. Langendorff-metoden er utmerket for å isolere mus VMs22, men suksessraten for å isolere AMs er lav, og få rapporter er tilgjengelige. Riktig dybde av aortakanokulasjon er også en viktig faktor for å gi ideelle virtuelle maskiner bortsett fra temperatur, enzymaktivitet, PH og vannkvalitet som brukes til bufferforberedelse. Prinsippet om Langendorff-metoden er avhengig av retrograd perfusjon av hjertet. Ved perfusjon er aortaventilen lukket; Dermed blir perfusatet tvunget inn i koronararteriene, og leverer enzymløsning gjennom kargrenene, og myokardvevet er jevnt fordøyd. For å oppnå denne typen sirkulasjonsmønster må aorta reservere nok lengde for kanylering og ligasjon, også kanylespissen må ikke trenge inn i aortaventilene eller blokkere CA-ostiumet. Dermed er det rimelig å spekulere i at dybden av aortakannasjon også er forbundet med atria perfusjon, noe som påvirker fordøyelseseffekten av atriene og utbyttet av AM på en lignende måte. Protokollen som presenteres her bekreftet hypotesen, og viktige trinn for å optimalisere celleutbyttet sammen med forslagene er notert nedenfor.
I trinn 1.9, for bedre å sikre aorta, anbefales en stump 20 G kanyle med et hakk (eller et omkretsspor) hvorfra avstanden er 1 mm til spissen. Basert på våre erfaringer ble kanylestørrelsen som er litt større enn aortaens diameter funnet for å forhindre at kanylespissen punkterer aortaventilene under kanylering fordi aorta, avhengig av dens iboende elastisitet, kan passe godt inn i kanylen og produsere friksjon, som fungerer som en beskyttende faktor når du beveger deg fremover eller bakover justere kanyleringsdybden. Når det gjelder hakkets posisjon, vil hjertet lett gli av under kanylering på grunn av tyngdekraften hvis det er for nær kanylespissen. Omvendt vil plassen for justering av kannasjonsdybden og ligasjonsposisjonen være svært begrenset hvis for langt. Gitt disse omstendighetene, transektere aorta mellom venstre vanlig halspulsåre (som den grønne linjen i figur 2) for å sikre at aorta er lang nok og kan kanyleres og ligated på stigende aorta er bedre i trinn 3.3. Mens transecting på stigende aorta, reservert lengde for kanylering i det minste kunne sikre kanyle spissen nær aorta roten og vil ikke trenge inn i aorta ventiler etter ligasjon. Anatomien til aorta og måling av avstanden fra kanylespissen til CA-ostium indikerer at transektering av aorta mellom venstre vanlig halspulsåre er en ideell posisjon for å oppnå en riktig aortakanyleringsdybde.
Kannasjonsdybden ble funnet å være forbundet med atrierens perfusjon, som igjen fungerer som en dybdeindikator. Figur 4 viser at atria perfusjon er god når dybden er på stigende aorta, og begge atrievedleggene er oppblåst. Atria perfusjon er imidlertid utilstrekkelig når dybden er på (eller nærmer seg) aortaroten og begge atrievedhengene er wizened. Det totale og levedyktige antallet AM som ble gitt fra de oppblåste atrievedleggene, var høyere (figur 8). Disse funnene indikerer at aortakanokulasjonsdybden kan påvirke perfusjonen og fordøyelsen av atri- og atrievedleggene på en bestemt måte og til slutt påvirke AM-utbyttet og kvaliteten. Avkastningen og kvaliteten på AM ble utledet for å være knyttet til fordelingen av fartøyene som forsyner atriene. Studien av Fernández et al.23 har vist ulike uregelmessigheter i opprinnelsen og løpet av mus CA. De fant ut at CAs ostia var svært variabel og ikke alle var lokalisert i den aorta sinus. Noen CAer kan stamme uregelmessig ovenfra de aorta bihulene, kalt den høye take-off ostium. Noen CAer kan stamme fra samme aorta sinus, og ostium av atrium fartøyet er like i nærheten. Anatomien til aorta i den nåværende studien (figur 10) er også i samsvar med funnet av Fernández. Dette kan være årsaken til at forsøk på å isolere AM ved Langendorff-metoden i stor grad har vært mislykket hvis kanodybden ikke er hensiktsmessig. Dermed vil kanylespissen ha større sjanse for å blokkere atriumfartøyet ostium som ligger ved siden av CA-ostiumet hvis det ikke er nok plass mellom kanylespissen og CA-ostiumet. Til sammenligning ble perfusjonen og celleutbyttet av ventrikelen knapt påvirket så lenge aortaventilene ikke ble penetrert av kanylespissen. Dette er sannsynligvis fordi CAene som leverer blod til ventrikelen har større ostia og mer opprinnelse. Hvis ett ostium ble okkludert av kanylene, kan ventrikkelperfusjon kompenseres av en annen CA eller sikkerhetssirkulasjonen, mens blodkaret som forsyner atriet er ganske lite og ikke har noen erstatning. Dermed er påvirkningen av dybden i aortakanokulasjon viktig.
Andre bemerkelsesverdige faktorer og feilsøkinger i fordøyelsen og cellelagringsprosessen er oppført som følger. Først bør du vurdere perfusing oksygenert Tyrodes løsning i trinn 4.1 for å få muskelen til å trekke seg sammen og pumpe ut gjenværende blod hvis blodet i atriene ikke har blitt rushed ut etter aorta ligation. Dette kan bidra til å unngå den negative effekten av ca2+ og andre materialer som frigjøres fra de skadede erytrocyttene. For det andre kan perfusing ca2 +-fri løsning på forhånd for å fjerne forbindelsen og utvide avstanden mellom celler forbedre effekten av enzym fordøyelse fordi interkalibrerte disker mellom CMs er kalsiumavhengige intercellulære kryss. Tiden bør imidlertid begrenses til 3-5 min for å unngå kalsiumparadoksfenomenet24. En blandet enzymløsning anbefales. Kollagenalal type II forstyrrer det ekstracellulære matrisenettverket, og trypsin bidrar til å fjerne det granulære materialet som forblir på celleoverflaten hvis kollagen ii fordøyelsen er ufullstendig. Dette sikrer en jevn celleoverflate, som er avgjørende for å danne en GΩ-forsegling i patchklemmeopptaket. Likevel bør trypsinkonsentrasjonen kontrolleres i riktig område for å unngå over fordøyelse og celleskade fordi det kan forringe membranproteinet. Bruk av kollagenalal type II alene for å forbedre celleutbyttet kan ofte føre til vev over fordøyelsen, og de isolerte CMs vil være kalsiumintoleranse etter langvarig kollagenalisseeksponering25. Bruken av 2,3-butanedione monoksim (BDM), et stoff som forhindrer spontan sammentrekning ved å hemme myosin ATPase og forhindre kryssbrodannelse, er fortsatt kontroversielt26,27,28,29. Ifølge tidligere erfaring er det nødvendig å legge til BDM for denne protokollen. Enzymoppløsning fremstilles med løsning 1 selv om løsning 1 ikke inneholder kalsium, og kalsium tilsetts for å aktivere enzymet. Fordelen med å tilsette BDM i perfusjonsløsningen inkluderer (1) hemming av myocytter sammentrekning og reduksjon av oksygenforbruk under enzymoppløsningsperfusjon og (2) å forhindre myocytter fra hypoksi og forbedre kvaliteten på de isolerte myocyttene. Noen studier rapporterte at BDM kan ha en potensiell negativ innvirkning på cellulære elektriske egenskaper. Resultatene av klemmeopptaket av natriumstrømmen i hele cellen indikerte imidlertid ikke en uønsket effekt. I cellelagringstrinnet (trinn 6) har mange studier valgt KB-bufferen, en kalsiumfri, men høy kaliumkonsentrasjonsløsning, der celler kan opprettholde en bedre tilstand fordi de er i polariserte og lave metabolske forhold. Imidlertid vil glykokalyxen i cellemembranen skille seg fra lipidbilayeren i fravær av eksogent kalsium i en viss tid, og membranpermeabiliteten vil øke, noe som påvirker den påfølgende funksjonelle analysen30,31,32.
Alle myocytter isolasjon teknikker kan i hovedsak kategoriseres for tiden i enten chunk (et lite stykke vev) fordøyelse i en enzymatisk løsning eller CA perfusjon med enzymatisk løsning (Langendorff perfusjon)22. Sammenlignet med Langendorff-metoden er chunk-fordøyelsesmetoden enklere å utføre og brukes også rutinemessig til å isolere CMs i mange laboratorier. Imidlertid produserer denne metoden normalt et lavt utbytte av CMs av dårlig kvalitet fra voksne vev22. Videre kan celler isolert av denne metoden ikke være egnet for å utføre komparative eksperimenter. Når du for eksempel tester celletypespesifikke legemiddeleffekter mellom AM og VM, kan ikke virkningen av ulike isolasjonstilstander overses eller utelukkes. Dette skyldes at myokardiet og vevstettheten til ventrikelen er mye tykkere og tettere enn atriumet, noe som resulterer i forskjellige fordøyelsestider og enzymkonsentrasjoner. Videre vil overdreven agitasjon og pipettering av vevet under fordøyelsen skade cellene og påvirke funksjonelle studier betydelig. Videre har mange tidligere studier vist at AMs er mer sårbare for kalsium. Imidlertid kan AMs isolert av den nåværende protokollen være tolerante for gradient kalsiuminnføring sannsynligvis fordi vevet er lett å briste på slutten av fordøyelsesprosessen. Dermed er mekanisk skade mindre, mens celler vil lide mer mekaniske skader ettersom trinn i chunk-metoden trenger gjentatt brudd og sentrifugal. Mer nylig rapporterte Ackers et al.33 en forenklet, Langendorff-fri metode for isolering av levedyktige hjertemyocytter og ikke-fyocytter. Virtuelle maskiner og fibroblaster kan isoleres effektivt, men mengden AMs ble ikke nevnt. Denne protokollen har imidlertid flere begrensninger. For det første kan fordelingen av hjerteblodkarene ha variasjoner for individuelle forskjeller og musstamme, og den anbefalte kannasjonsdybden kan ikke garantere en vellykket AMs-isolasjon for hver gang. For det andre, for de som er nye i denne prosedyren kan ta en viss tid å praktisere aorta transeksjon og retrograd aorta kannasjon. Til slutt ble denne metoden ikke testet i andre hjertesykdomsmodeller bortsett fra hos friske og eldre mus. Derfor vil det kreve justeringer i enzymkonsentrasjoner og fordøyelsestid på grunn av hjertets fibroseutbredelse. Ulempen med forskjellige fordøyelsesforhold som oppstår i delmetoden, vil ikke være et problem i Langendorff-metoden der enzymoppløsningen fordeles jevnt til vevet av karsengene.
Oppsummert har protokollene for samtidig isolasjon av enkelt AM og VM beskrevet her vist at riktig aortakanokulasjonsdybde effektivt kan forbedre atriumperfusjon og AM-utbytte. CMs isolert av denne metoden er av høy kvalitet, har god kalsiumtoleranse, og har blitt brukt til patch klemmeopptak og kalsiumhåndtering (Ca2 + release og Ca2 + bølgemåling av IonOptix-systemet) i team34. Det forventes at isolasjonsprotokollen kan brukes til celleforberedelse i en rekke cellulære og subcellulære undersøkelser, noe som vil bidra til å utdype forståelsen av hjertefysiologi og patologi. Viktigst, det vil muliggjøre oppdagelsen av mer klinisk relevante hjertesykdomsmekanismer og intervensjonsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (Nr. 81770322, 81870244, 81500254, 81870243, 81470465) og Beijing Natural Science Foundation (nr. 7192051). Forfatterbidrag: Bai og Liu designet og unnfanget prosjektet. Wen og Ruan ga verdifulle råd til eksperimentene. Wu og Linling Li utførte det eksperimentelle arbeidet og spilte nøkkelroller i datainnsamling, analyse og tolkning. Li deltok i Langendorff-apparatet. Peng, Zhang, Wang og Yang deltok i utarbeidelsen av reagensene og løsningene før eksperimentet. Wu skrev artikkelen.
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |