Modifikasjoner av Langendorff-metoden for samtidig isolasjon av atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus

Summary

Denne protokollen beskriver modifikasjoner av Langendorff-metoden, inkludert dybden av aortakannasjon for samtidig isolering av atrie- og ventrikulære myocytter fra voksne mus.

Abstract

En enkelt kardiomyocytt er et viktig verktøy i cellulære og subcellulære nivåstudier av hjertebiologi og sykdommer som en grunnleggende enhet for sammentrekning og elektrisk aktivitet. Derfor er det første og mest avgjørende eksperimentelle trinnet å isolere levedyktige kardiomyocytter av høy kvalitet fra hjertet. Sammenligning av de ulike protokollene for å isolere kardiomyocytter av voksne mus, langendorff retrograd perfusjon er den mest vellykkede og reproduserbare metoden rapportert i litteraturen, spesielt for å isolere ventrikulære myocytter. Imidlertid er det fortsatt utfordrende å isolere kvalitetsatrie-myocytter fra det perfused hjertet, og få vellykkede isolasjonsrapporter er tilgjengelige. Å løse dette kompliserte problemet er ekstremt viktig fordi bortsett fra ventrikkelsykdom, står atriesykdom for en stor del av hjertesykdommer. Derfor er ytterligere undersøkelser på cellenivå for å avsløre mekanismene berettiget. I dette dokumentet innføres en protokoll basert på Langendorff retrograd perfusjonsmetode, og noen modifikasjoner i dybden av aortakanokulering og trinnene som kan påvirke fordøyelsesprosessen for å isolere atrie- og ventrikulære myocytter, ble samtidig gjort. Videre er de isolerte kardiomyocyttene bekreftet å være mottagelige for å lappe klemmeundersøkelse.

Introduction

Hjertesykdom er en av de ledende globale årsakene til ^dødelighet1. For å møte denne byrden på helsevesenet er en grundig forståelse av hjertets fysiologi og patologi viktig. Foruten hele dyr og intakt hjerteforberedelse, er cellulær forberedelse et annet uunnværlig verktøy for funksjonell og sykdomsstudie2. Ved å bruke patchklemmen, kalsiumavbildning, molekylærbiologi og andre avanserte teknologier, kan forskere få mer informasjon om elektrofysiologiske egenskaper, kalsium homeostase, signalveier, metabolske tilstander og gentranskripsjoner i en enkelt kardiomyocytt (CM). Dette er ekstremt nyttig for å avsløre de fysiologiske og patologiske mekanismene i hjertesykdomsprosessen3,4,5,6,7. For dyreforskning kan arter som spenner fra små (f.eks. mus, rotter og marsvin) til store (f.eks. kaniner og hunder) dyr brukes. Små dyr er vanligvis foretrukket, spesielt mus, fordi de er mottagelige for genetisk og sykdomsmodellmanipulering8,9,10.

Teknikker for akutt isolerte CMs har gjennomgått en lang utviklingsperiode og utvikler seg ^fortsatt11. Langendorff retrograd perfusjon er den mest vellykkede og reproduserbare CMs isolasjonsmetoden som brukes hos rotter og mus, spesielt for å isolere ventrikulære myocytter (VMs)12,13,14,15. Rapporter om vellykket isolerte atrie-myocytter (AMs) er imidlertid knappe16,17,18. Videre undersøkelser av både nivåer av hele organet/systemet og cellulær/subcellulær for å avdekke mekanismene og utforske nye terapeutiske tilnærminger er berettiget fordi atrieflimmer (AF), den vanligste typen arytmi, i økende grad blir utbredt globalt, og dagens behandlingsmodaliteter i både farmakologiske terapier og hjerteablasjon forblir ineffektive hos omtrent 40% -50% av ^{AF-pasientene19} . Vellykket CMs-isolasjon for voksne mus er det første trinnet for cellulær studie. To primære isolasjonsmetoder kan brukes: del- og Langendorff-metodene. I Langendorff perfusjonsmetoden avhenger vevsfordøyelsen av enzymoppløsningen som leveres av koronararteriene og deres grener til kapillære senger. En riktig aortakanouleringsdybde som kan unngå å trenge inn i aortaventilene og blokkere koronararterien ostia er forutsetningen for å oppnå et slikt perfusjonsmønster, som også er det essensielle trinnet for effektiv fordøyelse og ideelt VM-utbytte. Derfor er det rimelig å anta at aortakanokulasjonens dybde på samme måte kan påvirke atriafartøyets perfusjon og til slutt påvirke AM-utbyttet. For å teste denne hypotesen ble aortakanokulasjon på forskjellige dybder utført og de tilsvarende AM-utbyttene ble sammenlignet. Dataene viste at aortakanokulasjonsdybden er direkte relevant for AM-utbyttet. Heri introduseres en protokoll for å isolere AMs og virtuelle maskiner samtidig.

Protocol

Voksne mannlige C57BL/ 6 mus som veier 20-30 g, 8-10 ukers alder ble kjøpt fra Animal Centre of Capital Medical University, Beijing, Kina. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved Capital Medical University og ble utført i samsvar med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals foreslått av Institute of Animal Resources og publisert av National Institutes of Health. Excel og Origin 8.5 ble brukt til datainnsamling og analyse. Data presenteres som midler ± SD, for statistisk evaluering ble Student t-test brukt og P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. 1. Forberedelse av løsnings- og perfusjonsapparater Monter et konstant flow Langendorff-apparat (kommersielt tilgjengelig eller selvfremstilt). Figur 1 gir et enkelt skjema. Klargjør løsningene i henhold til reagensene som er angitt i tabell 1 og tabell 2. Slå på det sirkulerende vannbadet og juster en passende inngangstemperatur (42,7 °C i laboratoriet vårt) for å sikre at det perfusate sirkulasjonssystemets utstrømning fra kanylen når 37 °C. Rengjør perfusjonssystemet ved å sirkulere deionisert vann. Hvis en steril tilstand er nødvendig, kjør 75% etanol gjennom perfusjonssystemet i 15 minutter, etterfulgt av deionisert vann (minst 10 sykluser for å unngå alkoholtoksisitetseffekter på hjertet). Mål tid og volum for en syklus av det perfusate sirkulasjonssystemet for å bestemme hvor mange milliliter oksygenert Tyrodes løsning som skal lastes i følgende perfusjonstrinn. Steriliser alle kirurgiske verktøy i ønsket metode. Still inn strømningshastigheten til det perfusate perfusjonssystemet på 4 ml/min. Forbered to rene 35 mm Petri retter-en som inneholder Tyrodes oppløsning (Petri tallerken 1), den andre inneholder løsning 1 (Petri tallerken 2). Forbered en 1 ml sprøyte fylt med oppløsning 1 og en 20 G stump stålkanyle med et hakk hvor avstanden er 1 mm til spissen. Forbered en løs knute med 3-0 sutur til kanyleakselen. Reguler visningsfeltet til stereomikroskopet og sørg for at kanylespissen er under den flytende overflaten av Petri-parabolen 2. 2. Dyreforberedelse Administrer heparin (konsentrasjon, 1000 IE/ml; 0,2 ml/mus) intraperitonealt til musene for å unngå blodpropp. Etter 10 min bedøves musene med natrium pentobarbital (50 mg / kg, I.P. injeksjon) og sørg for at musene slutter å reagere på hale / tå klemmer. Utfør cervical dislokasjon 20 min etter heparin administrasjon. Overfør musene til den kirurgiske plattformen, fest musene i en liggende stilling, steriliser brystet med 75% etanol, og tørk det med gasbind eller serviett. 3. Hjerteeksisjon og aortakanokulasjon Løft huden på xiphoid med vev tang og gjør et mindre lateralt snitt gjennom huden med vev saks. Utfør en stump disseksjon mellom huden og fascia og utvid snittet av huden i en V-form mot axillaen på begge sider. Fortsett det samme snittsporet gjennom ribbeburet, og avbøy deretter ribbeburet oppover ved å klemme brystbenet med vevs tang for å eksponere hjertet og lungene fullt ut. Skrell av perikardiet ved hjelp av buede tang. Riv tymuskjertelen mot begge sider med to buede tang hvis den dekker de store karene. Trekk forsiktig hjertets base mot halen med buede tang til et “Y”-formet blodkar (aorta og grenarteriene) kan ses. For å reservere forskjellige lengder av aorta for kannasjon og sammenligning, transekter aorta til venstre vanlig halspulsåre (grønn linje i figur 2) og kutt brachiocephalic arterien samtidig i noen mus. Transekt ved stigende aorta hos andre mus (svart linje i figur 2).MERK: For de som er nye i denne prosedyren, kan dette trinnet også gjøres under et stereoskopisk mikroskop. Sluk hjertet, og senk umiddelbart ned i Petri-tallerken 1 for å vaske og pumpe ut restblodet. Overfør hjertet til Petri dish 2, og trim eventuelt overskuddsvev ved hjelp av fin irissaks om nødvendig. For de som er nye i denne prosedyren, gjør dette trinnet under stereomikroskopet for å unngå feilaktig å kutte aorta eller andre hjertestrukturer. Skyv sprøyten for å utvise luftbobler før aortakanokulasjon. Utfør retrograd aortakanokulering ved hjelp av to rette bindende tang (glatte kjever) under stereomikroskopet. Forsikre deg om at hele kannkuleringsprosessen er under væskeoverflaten. Unngå å trenge inn i aortaventilene og juster dybden til den stigende aorta (musen som aorta ble transektert ved venstre vanlige karotisarterie) og aortaroten (musen som aorta ble transektert ved henholdsvis stigende aorta).MERK: Dybden av aortakanylering (referert til som bare som dybde) er her definert som posisjonen der kanylespissen er i aorta eller hvor aorta er ligated. Ligate aorta med pre-knute 3-0 sutur til kanylen hakket. Trykk forsiktig på sprøyteinnholdet for å skylle restblodet.MERK: Blodet vil etterlate koronararteriene og effuse fra dorsale årer Hvis dybden er riktig plassert. Hjertet og atrievedleggene vil ekspandere og bli bleke. Fjern og koble kanylen til Langendorff-apparatet. Nok en gang, pass på å unngå at luftbobler kommer inn i hjertet.MERK: Vær oppmerksom på at tiden fra thoracotomy til første perfusjon ikke bør overstige 5 min. 4. Hjerteperfusjon Først, prime og perfuse oksygenert Tyrodes løsning i ca 10 s (volumet av væske som kjører 10 s i systemet som brukes i denne protokollen er ca. 0,7 ml) hvis det er gjenværende blod i atriene, og bytt deretter til løsning 1. Men bare parfyme med løsning 1 Hvis det ikke er gjenværende blod i atriene. Forvrenge hjertet i ca. 2 min. Bytt til løsning 3. Sug ca. 2,5 ml oppløsning 3 med en engangs steril polyetylenpipet og forvarm den i vannbadet til senere bruk, med resten brukt til perfusjon i ca. 11-12 min. Kast oppløsning 3 perfundert i de første 2 min. Resirkuler resten til de perfusate reservoarene av den peristaltiske pumpen for gjenbruk til fordøyelsen er fullført. Avslutt fordøyelsen når hjertet blir hovent og blir litt blek og slapp (svampete tekstur) eller et avtrykk eksisterer hvis myokardiet klemmes forsiktig ved hjelp av tann tang. 5. Celleisolasjon og kalsiuminnføring Fjern ventriklene og atriene med tang, og legg dem i forskjellige Petri-retter. Tilsett den forhåndsvarsmede løsningen 3 i Petri-rettene. Triturat vevet inn i en uklar tekstur med stumpe tang og forsiktig pipette vevet for jevn fordøyelse. Unngå å introdusere luftbobler. Overfør det uklare fordøyde vevet med pipetten til løsning 4 for å arrestere den gjenværende enzymaktiviteten, og sentrifuger deretter i 20 s ved 192×g. Fjern supernatanten og tilsett løsning 5 i cellesedimentet og pipetten for å spre cellene jevnt. Gjeninnføre kalsium trinnvis for å unngå kalsiumparadoks og kalsiumoverbelastning. Tilsett gradvis totalt 50 μL 100 mM/L CaCl2 (ved hvert 5. minutts intervall på henholdsvis 5 μL, 10 μL, 15 μL og 20 μL) til celleopphenget. 6. Lagring av celler Oppbevar cellene i Tyrodes løsning for patchklemmestudien. For andre cellulære studier, lagre cellene i løsning 6. For å sikre nøyaktigheten av akutte funksjonelle studiers (f.eks. Ca2+ gnister, Ca2+ bølger, Ca2+ release, Ca2 + lekkasje og patch clamp-opptak), fullfør denne typen funksjonelle eksperimenter i løpet av de neste 6 h.

Representative Results

Dette papiret, hvor kanylespissen er plassert i aorta, som er definert som dybden av aortakanylering (referert til bare som dybde), representerer også hvor aorta er ligated. AM og VM isolert fra et hjerte som ble kanylert og ligatert på stigende aorta er representert som AMAA og VMAA, henholdsvis. Videre er AM og VM isolert fra et hjerte som ble kanylert og ligatert ved aortaroten representert som henholdsvis AMAR og VMAR. Figur 2 viser oversikten over aorta- og transeksjonsposisjonene. Figur 3 viser også dybder og ligation steder som tilsvarer aorta transeksjonsposisjoner. Dybde var knyttet til atria og atrievedleggenes perfusjon. Begge atrievedleggene blåses opp når kanylespissen er på stigende aorta, noe som indikerer tilstrekkelig atria perfusjon. Men når du er ved aortaroten, er atria perfusjon utilstrekkelig og begge atrievedleggene er wizened (figur 4). CM-morfologien og levedyktigheten som er isolert fra de kanylerte hjertene på forskjellige dybder etter kalsiuminnføring (figur 5). Cellemorfologier av AMAA, AMAR, VMAA og VMAR er under det konfokale mikroskopet før og etter kalsiuminnføring. AMs er spindelformede, mens virtuelle maskiner er stangformede med rektangulære ender. Videre har AMs og virtuelle maskiner intakte membraner, klare konturer, klare strikkede sarkomere og glattoverflate (figur 6). Celle levedyktighet ble vurdert via trypan blå farging. Normale celler med intakte membraner kan utelukke trypanblått og vil ikke bli farget, mens celletapsaktivitet vil intracellulært raskt akkumulere trypanblå (figur 7). AMs og virtuelle maskiner ble plassert i forskjellige objektlysbilder for å utføre celletelling. Det totale utbyttet av AM og prosentandelen av levedyktige spindelformede CMs (overlevelsesrate) ble bestemt ved å overføre 10 μL av celleopphenget til et objektsklie og telt under et invertert fasekontrastmikroskop ved 4 × 10 synsfelt. Den samme metoden ble brukt til å bestemme den totale avkastningen for virtuelle maskiner (stangformet) og prosentandelen av levedyktige virtuelle maskiner. Denne metoden foretrekkes fremfor å bruke et hemocytometer, fordi CMs ikke lett fordelt på telleområdet til hemocytometeret på grunn av deres størrelse og form. En stolpegraf (figur 8) viser overlevelsesraten for AMAA, AMAR, VMAA og VMAR før og etter gjeninnføring av kalsium. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD fra 10 mus. Før kalsiuminnføring er overlevelsesraten for AMAA betydelig høyere enn for AMAR (70,9% ± henholdsvis 2,8% og 41,0% ± 5,2%; p < 0,01). Etter kalsiuminnføring er overlevelsesraten for AMAA betydelig høyere enn for AMAR (69,4% ± henholdsvis 3,0% og 37,7% ± 4,9%; p < 0,01). VMAA-overlevelsesraten var ikke forskjellig fra VMAR (89,5% ± 2,7% vs 88,1% ± henholdsvis 2,6%; p > 0,05) før gjeninnføring av kalsium. På samme måte var ikke VMAA-overlevelsesraten forskjellig fra VMAR (82,2% ± henholdsvis 1,9% vs. 82,9% ± 1,6%; p > 0,05) etter kalsiuminnføring. Et hjerte kanylert i dybden som denne protokollen anbefalte (ved stigende aorta), en levedyktig virtuellm og AMs avkastning på henholdsvis ca. 4,1 millioner og ca. 180 000 etter kalsiuminnføring. Helcellet patchklemmeopptak av natriumstrømmen (figur 9A, B) og strømtetthet (figur 9C) i isolert AM og VM bekrefter at cellekvaliteten har oppfylt kravene til elektrofysiologiske eksperimenter. Anatomien til aorta (figur 10) viser at ostium av atriefartøyet er nær aortaroten og ligger ved siden av ostiumet i koronararterien (CA). Tabell 3 viser avstanden fra kanylespissen til CA-ostium av hjerter kanylert og ligatert ved henholdsvis stigende aorta og aortaroten. Figur 1. Skjematisk diagram over et montert, modifisert Langendorff-system. Dette systemet er økonomisk og bærbart for brukerne. Den har to deler plastrør-en for vannet (indre diameter, 8 mm) og en for perfusate (indre diameter, 1,5 mm)-hvorav den distale enden er koblet til en PE medisinsk treveis stoppekran med luerlås. En glassflaske som inneholder vann og med en gummiproppform som varmeveksler. Perfusatet pumpes inn i plastslangen i varmeveksleren av den peristaltiske pumpen og kommer ut fra den treveis stoppekranen som er koblet til kanylen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2. Aorta og vev rundt. En “Y”-formet blodkarstruktur er aorta og dens grener: den brachiocephalic arterien (pil 1) og venstre vanlige halspulsåre (pil 2). Transekt aorta mellom venstre vanlig halspulsåre (grønn linje) og samtidig kutte brachiocephalic arterien i noen mus; ved stigende aorta (svart linje) i andre mus (stereomikroskop 10 × 2 forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3. Frontal utsikt over det kanylerte hjertet. Den svarte buede linjen representerer den incisal kanten av aorta som ble transektert mellom venstre vanlig halspulsåre. Den røde buede linjen representerer den incisal kanten av aorta transektert ved stigende aorta. Den rette linjen representerer hvor aorta ble ligatert: svart ved stigende aorta og rød ved aortaroten (stereomikroskop 10 × 2 forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4. Perfusjonstilstanden til de kanylerte hjertene. Atriene er tilstrekkelig perfundert, og begge atrievedleggene er oppblåst i hjertet (A) kanylert og ligatert ved stigende aorta. Imidlertid er begge atrievedhengene wizened i hjertet (B) kanylert og ligatert ved aortaroten, noe som indikerer dårlig atria perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5. Cellemorfologi og levedyktighetsevaluering etter kalsiuminnføring. AMs (A) og VMs (B) isolert fra hjertet kanylert og ligated på stigende aorta er representert som AMAAer og VMAAer, henholdsvis. AMs (C) og VMs (D) isolert fra hjertet kanylert og ligated ved aorta roten er representert som AMARs og VMARs, henholdsvis. CMs av høy kvalitet er passiviser og har intakte membraner, klare konturer, klare strikkede sarkomere og en jevn celleoverflate. AMs er spindelformede, mens virtuelle maskiner er stang- eller mursteinformede med rektangulære ender. CMs som spontant kontrakt eller inneholder blebs i membranen er av dårlig kvalitet, og de som krymper inn i en sfærisk form er døde celler. Et tilfeldig synsfelt (fluorescensmikroskop, 10 × 10 forstørrelse; skalastenger, 100 μm). AM = atrie myocytt, VM = ventrikulær myocytt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6. Cellemorfologi under et konfokalt mikroskop før og etter kalsiuminnføring. Før kalsiuminnføring er AMAA (A) og AMAR (C) spindelformede med klare konturer, strikkede sarkomer og glatte membranoverflater. Etter kalsiuminnføring er AMAA (B) og AMAR (D) også spindelformede med klare konturer, strikkede sarkomer og glatte membranoverflater. Før kalsiuminnføring er VMAA (E) og VMAR (G) stang- eller mursteinformede med klare konturer, striate sarkomere og glatte membranoverflater med rektangulære ender. Etter kalsiuminnføring er VMAA (F) og VMAR (H) også stang- eller mursteinformet med klare konturer, strikkede sarkomer og glatte membranflater med rektangulære ender (konfokal mikroskopolje, 63 × 10 forstørrelsesstenger, 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7. Vurdering av celle levedyktighet. Skadede celler som mister aktivitet er farget av trypan blå. I motsetning kan levedyktige celler ikke farges av trypanblå (fluorescensmikroskop, 4 × 10 forstørrelse; skalastenger, 100 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 8. Bar graf som viser overlevelsesraten for AMAA, AMAR, VMAA og VMAR før og etter kalsiuminnføring. CR = kalsiuminnføring. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD fra 10 mus. p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Løsning Innhold (sluttkonsentrasjon i mmol/l, hvis ikke spesifisert annerledes) Bemerket Perfusjonsløsning (løsning 1) 113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurine, 5 Glukose, 10 2,3-butanedione monome (BDM) Som kan lagres i 3 dager ved 4 °C. Glukose, taurin og BDM tilsettes på eksperimentdagen. Forbered 200 ml perfusjonsløsning for hvert hjerte. Tyrodes løsning (løsning 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glukose Som kan lagres i 3 dager ved 4 °C. CaCl2 og glukose tilsettes på eksperimentdagen, juster pH til 7,3-7,4 med mettet NaOH ved romtemperatur (28-30 °C) med en PH-måler. Tabell 1. Løsninger for CM-isolasjon for voksne mus. Løsning Innhold Bemerket Fordøyelsesløsning (løsning 3) 25 ml oppløsning 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg kollagenalin II, 50μL (2,5 % 10×) trypsin for hvert hjerte Stopp løsning 1(løsning 4) 9 ml oppløsning 1, 1 ml FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 for hvert hjerte Stopp løsning 2 (løsning 5) 9,5 ml oppløsning 1, 0,5 ml FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 for hvert hjerte Celle resuspension løsning (løsning 6) 13 ml oppløsning 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) i en dose som kan danne et tynt lag som dekker overflaten av væsken for hvert hjerte Tabell 2. Løsninger for CM-isolasjon og lagring for voksne mus. Figur 9. Strømspenningskurver i natriumkanalene. Helcellede patchklemmeteknikker ble brukt til å registrere natriumstrømmer av de isolerte kardiomyocyttene i spenningsklemmemodus. Spenningsklemmeprotokollen er vist i innsettet. Natriumstrømmer registrert fra AM (A) og VM (B) vises. Dagens tettheter ved potensialer på -45 mV, −40 mV og −35 mV er signifikant høyere i AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± henholdsvis 1,820 pA/pF og −29,34 ± 1,939 pA/pF; n = 10) enn i VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± henholdsvis 1,560 pA/pF og −21,86 ± 1,381 pA/pF; n = 8; P < 0,05). (C) I-V-kurvene viser natriumstrømtetthetene som ble normalisert til cellekapasitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 10. Opprinnelse og distribusjon av atriefartøyet. Atriefartøyet (pil 1) og CA (pil 2) i panel A. Panel B er en nærmere titt på atriefartøyet (pil 3). (C) Det finnes to ostiaer i forskjellige størrelser; den ene (pil 4) tilsvarer atriefartøyet som vannet atrievedleggene, og den andre (pil 5) tilsvarer CA (stereomikroskop 10 × 5 forstørrelse). CA = koronararterie. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Serienummeret til musene 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dybden av aortakanokulasjon er ved stigende aorta 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 Dybden av aortakanokulasjon er ved aortaroten 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 Tabell 3. Avstand fra kanylespissen til koronararterien ostium. Hjertene til C57BL/6 mus (n = 20) ble brukt til å kanylere og ligate aorta på dybder av henholdsvis stigende aorta og aortaroten. Aorta er anatomisert, og avstanden fra kanylespissen til CA-ostiumet ble målt. Avstanden måles i millimeter, og positive eller negative tegn representerer henholdsvis kanylespissen over og under CA-ostiumet.

Discussion

Single CM er et verdifullt og uunnværlig verktøy i cellulære studier av hjertefunksjon og ^sykdommer20. Derfor er isolasjonen av levedyktige CMs fra hjertene det første og mest avgjørende trinnet. Cellekvalitet er en av de betydelige determinantene for å utføre vellykkede eksperimenter, spesielt i optiske og elektrofysiologiske eksperimenter. Sammenlignet med CMs av andre dyr, gnager CMs er mer sårbare for iskemi og hypoksi på grunn av en høyere konsentrasjon av intracellulære natriumioner, som favoriserer kalsiumtilstrømning gjennom Na ⁺ / ^{Ca2 + veksler21}. Dessuten er antall AMs langt mindre enn for virtuelle maskiner; Dermed er vellykket isolasjon ekstremt vanskelig å oppnå. Langendorff-metoden er utmerket for å isolere mus ^VMs22, men suksessraten for å isolere AMs er lav, og få rapporter er tilgjengelige. Riktig dybde av aortakanokulasjon er også en viktig faktor for å gi ideelle virtuelle maskiner bortsett fra temperatur, enzymaktivitet, PH og vannkvalitet som brukes til bufferforberedelse. Prinsippet om Langendorff-metoden er avhengig av retrograd perfusjon av hjertet. Ved perfusjon er aortaventilen lukket; Dermed blir perfusatet tvunget inn i koronararteriene, og leverer enzymløsning gjennom kargrenene, og myokardvevet er jevnt fordøyd. For å oppnå denne typen sirkulasjonsmønster må aorta reservere nok lengde for kanylering og ligasjon, også kanylespissen må ikke trenge inn i aortaventilene eller blokkere CA-ostiumet. Dermed er det rimelig å spekulere i at dybden av aortakannasjon også er forbundet med atria perfusjon, noe som påvirker fordøyelseseffekten av atriene og utbyttet av AM på en lignende måte. Protokollen som presenteres her bekreftet hypotesen, og viktige trinn for å optimalisere celleutbyttet sammen med forslagene er notert nedenfor.

I trinn 1.9, for bedre å sikre aorta, anbefales en stump 20 G kanyle med et hakk (eller et omkretsspor) hvorfra avstanden er 1 mm til spissen. Basert på våre erfaringer ble kanylestørrelsen som er litt større enn aortaens diameter funnet for å forhindre at kanylespissen punkterer aortaventilene under kanylering fordi aorta, avhengig av dens iboende elastisitet, kan passe godt inn i kanylen og produsere friksjon, som fungerer som en beskyttende faktor når du beveger deg fremover eller bakover justere kanyleringsdybden. Når det gjelder hakkets posisjon, vil hjertet lett gli av under kanylering på grunn av tyngdekraften hvis det er for nær kanylespissen. Omvendt vil plassen for justering av kannasjonsdybden og ligasjonsposisjonen være svært begrenset hvis for langt. Gitt disse omstendighetene, transektere aorta mellom venstre vanlig halspulsåre (som den grønne linjen i figur 2) for å sikre at aorta er lang nok og kan kanyleres og ligated på stigende aorta er bedre i trinn 3.3. Mens transecting på stigende aorta, reservert lengde for kanylering i det minste kunne sikre kanyle spissen nær aorta roten og vil ikke trenge inn i aorta ventiler etter ligasjon. Anatomien til aorta og måling av avstanden fra kanylespissen til CA-ostium indikerer at transektering av aorta mellom venstre vanlig halspulsåre er en ideell posisjon for å oppnå en riktig aortakanyleringsdybde.

Kannasjonsdybden ble funnet å være forbundet med atrierens perfusjon, som igjen fungerer som en dybdeindikator. Figur 4 viser at atria perfusjon er god når dybden er på stigende aorta, og begge atrievedleggene er oppblåst. Atria perfusjon er imidlertid utilstrekkelig når dybden er på (eller nærmer seg) aortaroten og begge atrievedhengene er wizened. Det totale og levedyktige antallet AM som ble gitt fra de oppblåste atrievedleggene, var høyere (figur 8). Disse funnene indikerer at aortakanokulasjonsdybden kan påvirke perfusjonen og fordøyelsen av atri- og atrievedleggene på en bestemt måte og til slutt påvirke AM-utbyttet og kvaliteten. Avkastningen og kvaliteten på AM ble utledet for å være knyttet til fordelingen av fartøyene som forsyner atriene. Studien av Fernández et ^al.23 har vist ulike uregelmessigheter i opprinnelsen og løpet av mus CA. De fant ut at CAs ostia var svært variabel og ikke alle var lokalisert i den aorta sinus. Noen CAer kan stamme uregelmessig ovenfra de aorta bihulene, kalt den høye take-off ostium. Noen CAer kan stamme fra samme aorta sinus, og ostium av atrium fartøyet er like i nærheten. Anatomien til aorta i den nåværende studien (figur 10) er også i samsvar med funnet av Fernández. Dette kan være årsaken til at forsøk på å isolere AM ved Langendorff-metoden i stor grad har vært mislykket hvis kanodybden ikke er hensiktsmessig. Dermed vil kanylespissen ha større sjanse for å blokkere atriumfartøyet ostium som ligger ved siden av CA-ostiumet hvis det ikke er nok plass mellom kanylespissen og CA-ostiumet. Til sammenligning ble perfusjonen og celleutbyttet av ventrikelen knapt påvirket så lenge aortaventilene ikke ble penetrert av kanylespissen. Dette er sannsynligvis fordi CAene som leverer blod til ventrikelen har større ostia og mer opprinnelse. Hvis ett ostium ble okkludert av kanylene, kan ventrikkelperfusjon kompenseres av en annen CA eller sikkerhetssirkulasjonen, mens blodkaret som forsyner atriet er ganske lite og ikke har noen erstatning. Dermed er påvirkningen av dybden i aortakanokulasjon viktig.

Andre bemerkelsesverdige faktorer og feilsøkinger i fordøyelsen og cellelagringsprosessen er oppført som følger. Først bør du vurdere perfusing oksygenert Tyrodes løsning i trinn 4.1 for å få muskelen til å trekke seg sammen og pumpe ut gjenværende blod hvis blodet i atriene ikke har blitt rushed ut etter aorta ligation. Dette kan bidra til å unngå den negative effekten av ^ca2+ og andre materialer som frigjøres fra de skadede erytrocyttene. For det andre kan perfusing ^{ca2 +}-fri løsning på forhånd for å fjerne forbindelsen og utvide avstanden mellom celler forbedre effekten av enzym fordøyelse fordi interkalibrerte disker mellom CMs er kalsiumavhengige intercellulære kryss. Tiden bør imidlertid begrenses til 3-5 min for å unngå kalsiumparadoksfenomenet24. En blandet enzymløsning anbefales. Kollagenalal type II forstyrrer det ekstracellulære matrisenettverket, og trypsin bidrar til å fjerne det granulære materialet som forblir på celleoverflaten hvis kollagen ii fordøyelsen er ufullstendig. Dette sikrer en jevn celleoverflate, som er avgjørende for å danne en GΩ-forsegling i patchklemmeopptaket. Likevel bør trypsinkonsentrasjonen kontrolleres i riktig område for å unngå over fordøyelse og celleskade fordi det kan forringe membranproteinet. Bruk av kollagenalal type II alene for å forbedre celleutbyttet kan ofte føre til vev over fordøyelsen, og de isolerte CMs vil være kalsiumintoleranse etter langvarig kollagenalisseeksponering25. Bruken av 2,3-butanedione monoksim (BDM), et stoff som forhindrer spontan sammentrekning ved å hemme myosin ATPase og forhindre kryssbrodannelse, er fortsatt kontroversielt26,27,28,29. Ifølge tidligere erfaring er det nødvendig å legge til BDM for denne protokollen. Enzymoppløsning fremstilles med løsning 1 selv om løsning 1 ikke inneholder kalsium, og kalsium tilsetts for å aktivere enzymet. Fordelen med å tilsette BDM i perfusjonsløsningen inkluderer (1) hemming av myocytter sammentrekning og reduksjon av oksygenforbruk under enzymoppløsningsperfusjon og (2) å forhindre myocytter fra hypoksi og forbedre kvaliteten på de isolerte myocyttene. Noen studier rapporterte at BDM kan ha en potensiell negativ innvirkning på cellulære elektriske egenskaper. Resultatene av klemmeopptaket av natriumstrømmen i hele cellen indikerte imidlertid ikke en uønsket effekt. I cellelagringstrinnet (trinn 6) har mange studier valgt KB-bufferen, en kalsiumfri, men høy kaliumkonsentrasjonsløsning, der celler kan opprettholde en bedre tilstand fordi de er i polariserte og lave metabolske forhold. Imidlertid vil glykokalyxen i cellemembranen skille seg fra lipidbilayeren i fravær av eksogent kalsium i en viss tid, og membranpermeabiliteten vil øke, noe som påvirker den påfølgende funksjonelle analysen30,31,32.

Alle myocytter isolasjon teknikker kan i hovedsak kategoriseres for tiden i enten chunk (et lite stykke vev) fordøyelse i en enzymatisk løsning eller CA perfusjon med enzymatisk løsning (Langendorff perfusjon)²². Sammenlignet med Langendorff-metoden er chunk-fordøyelsesmetoden enklere å utføre og brukes også rutinemessig til å isolere CMs i mange laboratorier. Imidlertid produserer denne metoden normalt et lavt utbytte av CMs av dårlig kvalitet fra voksne ^vev22. Videre kan celler isolert av denne metoden ikke være egnet for å utføre komparative eksperimenter. Når du for eksempel tester celletypespesifikke legemiddeleffekter mellom AM og VM, kan ikke virkningen av ulike isolasjonstilstander overses eller utelukkes. Dette skyldes at myokardiet og vevstettheten til ventrikelen er mye tykkere og tettere enn atriumet, noe som resulterer i forskjellige fordøyelsestider og enzymkonsentrasjoner. Videre vil overdreven agitasjon og pipettering av vevet under fordøyelsen skade cellene og påvirke funksjonelle studier betydelig. Videre har mange tidligere studier vist at AMs er mer sårbare for kalsium. Imidlertid kan AMs isolert av den nåværende protokollen være tolerante for gradient kalsiuminnføring sannsynligvis fordi vevet er lett å briste på slutten av fordøyelsesprosessen. Dermed er mekanisk skade mindre, mens celler vil lide mer mekaniske skader ettersom trinn i chunk-metoden trenger gjentatt brudd og sentrifugal. Mer nylig rapporterte Ackers et ^al.33 en forenklet, Langendorff-fri metode for isolering av levedyktige hjertemyocytter og ikke-fyocytter. Virtuelle maskiner og fibroblaster kan isoleres effektivt, men mengden AMs ble ikke nevnt. Denne protokollen har imidlertid flere begrensninger. For det første kan fordelingen av hjerteblodkarene ha variasjoner for individuelle forskjeller og musstamme, og den anbefalte kannasjonsdybden kan ikke garantere en vellykket AMs-isolasjon for hver gang. For det andre, for de som er nye i denne prosedyren kan ta en viss tid å praktisere aorta transeksjon og retrograd aorta kannasjon. Til slutt ble denne metoden ikke testet i andre hjertesykdomsmodeller bortsett fra hos friske og eldre mus. Derfor vil det kreve justeringer i enzymkonsentrasjoner og fordøyelsestid på grunn av hjertets fibroseutbredelse. Ulempen med forskjellige fordøyelsesforhold som oppstår i delmetoden, vil ikke være et problem i Langendorff-metoden der enzymoppløsningen fordeles jevnt til vevet av karsengene.

Oppsummert har protokollene for samtidig isolasjon av enkelt AM og VM beskrevet her vist at riktig aortakanokulasjonsdybde effektivt kan forbedre atriumperfusjon og AM-utbytte. CMs isolert av denne metoden er av høy kvalitet, har god kalsiumtoleranse, og har blitt brukt til patch klemmeopptak og kalsiumhåndtering (^{Ca2 +} release og ^{Ca2 +} bølgemåling av IonOptix-systemet) i ^team34. Det forventes at isolasjonsprotokollen kan brukes til celleforberedelse i en rekke cellulære og subcellulære undersøkelser, noe som vil bidra til å utdype forståelsen av hjertefysiologi og patologi. Viktigst, det vil muliggjøre oppdagelsen av mer klinisk relevante hjertesykdomsmekanismer og intervensjonsmetoder.

Materials

2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)