Modifieringar av Langendorff-metoden för samtidig isolering av förmaks- och ventrikulära myocyter från vuxna möss

Summary

Detta protokoll beskriver modifieringar av Langendorff metoden inklusive djupet av aorta cannulation för samtidig isolering av förmaksfläta och ventrikulära myocyter från vuxna möss.

Abstract

En enda kardiomyocyt är ett viktigt verktyg i cellulära och subcellulära studier av hjärtbiologi och sjukdomar som en grundläggande enhet för sammandragning och elektrisk aktivitet. Därför är isolering av livskraftiga, högkvalitativa kardiomyocyter från hjärtat det första och mest avgörande experimentella steget. Jämför de olika protokollen för att isolera kardiomyocyter hos vuxna möss, Langendorff retrograd perfusion är den mest framgångsrika och reproducerbara metoden som rapporteras i litteraturen, särskilt för att isolera ventrikulära myocyter. Isolera kvalitet förmakscelliga myocyter från perfused hjärtat är dock fortfarande utmanande, och få framgångsrika isolering rapporter finns tillgängliga. Att lösa detta komplicerade problem är extremt viktigt eftersom bortsett från ventrikulär sjukdom står förmakssjukdom för en stor del av hjärtsjukdomar. Därför är ytterligare undersökningar på cellnivå för att avslöja mekanismerna motiverade. I detta dokument, ett protokoll baserat på Langendorff bakåtsträvande perfusion metod införs och vissa ändringar i djupet av aorta cannulation och de steg som kan påverka matsmältningsprocessen för att isolera förmaksfläta och ventrikulära myocyter gjordes samtidigt. Dessutom bekräftas de isolerade kardiomyocyterna vara mottagliga för patch clamp undersökning.

Introduction

Hjärtsjukdomar är en av de främsta globala orsakerna till ^dödlighet1. För att ta itu med denna börda på hälso- och sjukvårdssystemet är en djupgående förståelse av hjärtats fysiologi och patologi avgörande. Förutom hela djur och intakt hjärtberedning är cellulär förberedelse ett annat oumbärligt verktyg för funktionell och ^{sjukdomsstudie2}. Genom att tillämpa plåsterklämma, kalciumavbildning, molekylärbiologi och annan avancerad teknik kan forskare få mer information om elektrofysiologiska egenskaper, kalciumhomeostas, signalvägar, metaboliska tillstånd och gen transkriptioner i en enda kardiomyocyt (CM). Detta är till stor hjälp för att avslöja de fysiologiska och patologiska mekanismerna i hjärtsjukdomsprocessen3,4,5,6,7. För djurforskning kan arter som sträcker sig från små (t.ex. möss, råttor och marsvin) till stora (t.ex. kaniner och hundar) djur användas. Små djur föredras vanligtvis, särskilt möss, eftersom de är mottagliga för genetisk och sjukdomsmodell manipulation8,9,10.

Tekniker för akut isolerade CMs har genomgått en lång utvecklingsperiod och utvecklas ^{fortfarande11}. Langendorff retrograde perfusion är den mest framgångsrika och reproducerbara CMs isoleringsmetoden som tillämpas hos råttor och möss, särskilt för att isolera ventrikulära myocyter (VIRTUELLA)12,13,14,15. Rapporter om framgångsrikt isolerade förmaksmässiga myocyter (AMs) är dock ^{knappa16,17,18}. Ytterligare undersökningar på båda nivåerna av hela organet/systemet och cellulära/subcellulära för att avslöja mekanismerna och utforska nya terapeutiska metoder är motiverade eftersom förmaksflimmer (AF), den vanligaste typen av arytmier, blir allt vanligare globalt, och nuvarande behandlingsmetoder i både farmakologiska terapier och hjärtablation förblir ineffektiva hos cirka 40-50% av ^{AF-patienterna19} . Framgångsrik isolering av vuxna mus-CMs är det första steget för cellulära studier. Två primära isoleringsmetoder kan användas: bit- och Langendorff-metoderna. I Langendorff perfusionsmetoden beror vävnadsrötning på enzymlösningen som levereras av kranskärlen och deras grenar till kapillärbäddarna. Ett korrekt aorta cannulation djup som kan undvika att penetrera aortaventilerna och blockera kranskärl ostia är förutsättningen för att uppnå ett sådant perfusion mönster, vilket också är det väsentliga steget för effektiv matsmältning och idealisk VM avkastning. Det är därför rimligt att anta att aorta cannulations djup på samma sätt kan påverka atriafartygets perfusion och slutligen påverka avkastningen på am. För att testa denna hypotes utfördes aorta cannulation på olika djup och motsvarande AM avkastning jämfördes. Uppgifterna visade att aorta cannulationsdjupet är direkt relevant för avkastningen på am-avkastning. Häri introduceras ett protokoll för att isolera AMs och virtuella datorer samtidigt.

Protocol

Vuxna manliga C57BL/6 möss som väger 20-30 g, 8-10 veckors ålder köptes från Animal Centre of Capital Medical University, Peking, Kina. Alla experimentella förfaranden godkändes av Animal Care and Use Committee vid Capital Medical University och utfördes i enlighet med guiden för vård och användning av laboratoriedjur som föreslagits av Institutet för djurresurser och publicerats av National Institutes of Health. Excel och Origin 8.5 användes för datainsamling och dataanalys. Data presenteras som medel ± SD, för statistisk utvärdering användes Studentens t-test och P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant. 1. Förberedelse av lösnings- och perfusionsapparater Montera en Langendorffapparat med konstant flöde (kommersiellt tillgänglig eller självtillverkad). Bild 1 ger ett enkelt schema. Förbered lösningarna enligt de reagenser som anges i tabell 1 och tabell 2. Slå på det cirkulerande vattenbadet och justera en lämplig ingångstemperatur (42,7 °C i vårt laboratorium) för att säkerställa att perfusatcirkulationssystemets utflöde från kanylen når 37 °C. Rengör perfusionssystemet genom att cirkulera avjoniserat vatten. Om ett sterilt tillstånd krävs, kör 75% etanol genom perfusionssystemet i 15 min, följt av avjoniserat vatten (minst 10 cykler för att undvika alkoholtoxicitetseffekter på hjärtat). Mät tid och volym för en cykel av perfusatcirkulationssystemet för att bestämma hur många milliliter syresatt Tyrodes lösning som ska laddas i följande perfusionssteg. Sterilisera alla kirurgiska verktyg i önskad metod. Ställ in flödeshastigheten för perfusatperfusionssystemet på 4 ml/min. Förbered två rena 35 mm Petri-rätter- en innehållande Tyrodes lösning (Petri-skål 1), den andra innehållande lösning 1 (Petriskål 2). Förbered en 1 ml spruta fylld med lösning 1 och en 20 G trubbig kanylnål av stål med ett hack från där avståndet är 1 mm till spetsen. Förbered en lös knut med 3-0 sutur till kanylaxeln. Reglera stereomikroscopets visningsfält och se till att kanylspetsen är under petriskålens flytande yta 2. 2. Beredning av djur Administrera heparin (koncentration, 1 000 IE/mL; 0, 2 ml/mus) intraperitoneally till mössen för att undvika blodproppar. Efter 10 min bedöva mössen med natriumpentobarbital (50 mg/kg, I.P. injektion) och se till att mössen slutar svara på svans/tå nypor. Utför livmoderhalscancer förskjutning 20 min efter heparin administration. Överför mössen till den kirurgiska plattformen, fixa mössen i en supin position, sterilisera bröstet med 75% etanol och torka det med gasväv eller servett. 3. Hjärtexcision och aorta cannulation Lyft xiphoidens hud med vävnadstång och gör ett mindre lateralt snitt genom huden med vävnadssax. Utför en trubbig dissekering mellan huden och fascian och utöka snittet av huden i en V-form mot axillerna på båda sidor. Fortsätt samma snittspår genom bröstkorgen och avled sedan revbenskorgen uppåt genom att spänna bröstbenet med vävnadstång för att helt exponera hjärtat och lungorna. Skala av perikardiumet med en böjd tång. Riv tymuskörteln mot båda sidor med två böjda tångar om den täcker de stora kärlen. Dra försiktigt hjärtats botten mot svansen med böjda tångar tills ett “Y”-format blodkärl (aortan och dess grenartärer) kan ses. För att reservera olika längder av aortan för kanylering och jämförelse, transect aorta vid vänster gemensam halsartär (grön linje i figur 2) och skära brachiocephalic gatan samtidigt i vissa möss. Transect vid den stigande aortan hos andra möss (svart linje i figur 2).OBS: För dem som är nya i denna procedur kan detta steg också göras under ett stereoskopiskt mikroskop. Ta bort hjärtat och sänk omedelbart ner i Petri-skålen 1 för att tvätta och pumpa ut det kvarvarande blodet. Överför hjärtat till Petri-skålen 2 och trimma eventuell överskottsvävnad med fin irissax om det behövs. För dem som är nya i denna procedur, gör detta steg under stereomikroskopet för att undvika att felaktigt skära aortan eller andra hjärtstrukturer. Tryck på sprutan för att driva ut luftbubblor före aorta cannulation. Utför retrograd aorta cannulation med hjälp av två raka bindningstång (släta käkar) under stereomikroskopet. Se till att hela kannulationsprocessen är under vätskeytan. Undvik att penetrera kolorektalventilerna och justera djupen till den stigande aortan (musen att aortan transected vid vänster gemensamma halsartär) och kolorektal rot (musen som aortan transected vid den stigande stora kroppspulsådern), respektive.OBS: Abtapuleringsdjupet (kallas enkelt djup) definieras här som den position där kanylspetsen finns i aortan eller där aortan är ligerad. Liga aortan med pre-knot 3-0 sutur till kanylskåran. Tryck försiktigt på sprutans innehåll för att skölja det kvarvarande blodet.OBS: Blodet kommer att lämna kranskärlen och effuse från dorsala vener Om djupet är korrekt placerat. Hjärtat och förmaksbihangen kommer att expandera och blekna. Ta bort och anslut kanylen till Langendorffapparaten. Återigen, var noga med att undvika att luftbubblor kommer in i hjärtat.OBS: Tänk på att tiden från thoracotomy till initial perfusion inte bör överstiga 5 min. 4. Hjärta perfusion Först, prime och perfuse oxygenated Tyrodes lösning för cirka 10 s (volymen vätska som kör 10 s i systemet som används i detta protokoll är cirka 0,7 ml) om det finns kvarvarande blod i förmaken, och sedan byta till lösning 1. Men bara perfuse med lösning 1 Om det inte finns något kvarvarande blod i förmaken. Perfusera hjärtat i ca 2 min. Byt till lösning 3. Sug ca 2,5 ml lösning 3 med steril polyetenrör för engångsbruk och förvarna det i vattenbadet för senare användning, resten används för perfusion i cirka 11-12 min. Kassera lösning 3 perfuserad under de första 2 minuterna. Återvinn resten till perfusatreservoarerna av den peristaltiska pumpen för återanvändning tills matsmältningen är klar. Avsluta matsmältningen när hjärtat blir svullet och blir något blekt och slappt (svampig konsistens) eller ett avtryck finns om myokardiet försiktigt kläms med en tandad tång. 5. Cellisolering och kalciumåterförduktion Ta bort ventriklarna och atria med tång och placera dem i olika Petri-rätter. Tillsätt den förvarnade lösningen 3 till Petri-disken. Triturera vävnaden till en grumlig konsistens med trubbiga tångar och rör försiktigt vävnaden för jämn matsmältning. Undvik att införa luftbubblor. Överför den grumliga smälta vävnaden med pipetten till lösning 4 för att stoppa den återstående enzymaktiviteten och centrifugera sedan i 20 s vid 192×g. Ta bort supernatanten och tillsätt lösning 5 i cellsedimentet och pipetten för att jämnt sprida cellerna. Återinför kalcium på ett stegvis sätt för att undvika kalciumparadox och kalciumöverbelastning. Tillsätt gradvis 50 μL 100 mM/L CaCl2 (med varje 5 minuters intervall på 5 μL, 10 μL, 15 μL respektive 20 μL) till cellfjädringen. 6. Celllagring För patchklämmastudien, förvara cellerna i Tyrlids lösning. För andra cellulära studier, lagra cellerna i lösning 6. För att säkerställa noggrannheten i akuta funktionella studiers resultat (t.ex. Ca2+ gnistor, Ca2+ vågor, Ca2 + release, Ca2 + läcka och patch clamp-inspelningar) avslutar du dessa typer av funktionella experiment inom de närmaste 6 h.

Representative Results

Detta papper, där kanylspetsen är placerad i aortan, som definieras som djupet av aorta cannulation (kallas helt enkelt djup), representerar också var aortan är ligerad. AM och VM isolerad från ett hjärta som kanylerades och ligerades vid den stigande storaorten representeras som AMAA respektive VMAA. Dessutom representeras AM och VM isolerad från ett hjärta som kanylerades och ligerades vid aorta roten som AMAR respektive VMAR. Figur 2 visar översikten över aortan och omfördelningspositionerna. Figur 3 visar också djupet och ligaturplatserna som motsvarar aortatransectionpositionerna. Djup var associerade med förmaken och förmaksbihangen perfusion. Båda förmaksbihangen blåses upp när kanylspetsen är vid den stigande aortan, vilket indikerar tillräcklig atriaperfusion. När vid aorta roten är dock atria perfusion otillräcklig och båda förmaksbihangen är wizened (figur 4). CM-morfologin och livskraften som isoleras från de kanylerade hjärtan på olika djup efter kalcium återintroduktion (figur 5). Cellmorfologier av AMAA, AMAR, VMAA och VMAR är under det konfokala mikroskopet före och efter kalcium återintroduktion. AMs är spindelformade, medan virtuella datorer är stavformade med rektangulära ändar. Dessutom har AMs och virtuella datorer intakta membran, tydliga konturer, tydliga strimmor och slätytade (figur 6). Cellens livskraft bedömdes via trypan blå färgning. Normala celler med intakta membran kan utesluta trypan blå och kommer inte att färgas, medan cellerna förlust aktivitet kommer intracellulärt snabbt ackumulera trypan blå (figur 7). AMs och virtuella datorer placerades i olika objektbilder för att utföra cellräkning. Den totala avkastningen av AM och procentandelen livskraftiga spindelformade CMs (överlevnadsgrad) bestämdes genom överföring av 10 μL av cell suspensionen till en objektbild och räknades under ett inverterat faskontrastmikroskop vid 4 × 10 synfält. Samma metod användes för att fastställa den totala avkastningen för virtuella datorer (stavformade) och procentandelen livskraftiga virtuella datorer. Denna metod föredras framför att använda en hemocytometer, eftersom CMs inte lätt distribuerade till hemocytometerns räkneområde på grund av deras storlek och form. Ett stapeldiagram (figur 8) visar överlevnadsgraden för AMAA, AMAR, VMAA och VMAR före och efter kalcium återintroduktion. Varje värde representerar medelvärdet ± SD från 10 möss. Före kalciumåterförandet är överlevnaden för AMAA betydligt högre än för AMAR (70,9% ± 2, 8% respektive 41,0% ± 5, 2%; p < 0,01). Efter kalcium återintroduktion är överlevnadsgraden för AMAA betydligt högre än för AMAR (69,4% ± 3, 0% respektive 37, 7% ± 4, 9%; p < 0,01). VMAA-överlevnadsgraden skilde sig inte från VMAR:s (89,5 % ± 2,7 % jämfört med 88,1 % ± 2,6 %. p > 0,05) före kalciumåterförduktion. På samma sätt skilde sig VMAA-överlevnaden inte från VMAR:s (82,2 % ± 1,9 % jämfört med 82,9 % ± 1,6 %. p > 0,05) efter kalciumintroduktion. Ett hjärta kanyleras på djupet som detta protokoll rekommenderade (vid den stigande aortan), en livskraftig virtuella och AMs avkastning på cirka 4,1 miljoner respektive cirka 180 000, efter kalcium återintroduktion. Registrering av natriumströmmen (figur 9A, B) och strömtätheten (figur 9C) i den isolerade AM och VM bekräftar att cellkvaliteten har uppfyllt kraven för elektrofysiologiska experiment. Aortans anatomi (figur 10) visar att ostiumet i förmakskärlet ligger nära aortaroten och ligger intill kranskärlets ostium (CA). Tabell 3 visar avståndet från kanylspetsen till CA-ostium av hjärtan kanyleras och ligerade vid den stigande aortan respektive aortan. Figur 1. Schematiskt diagram över ett monterat modifierat Langendorff-system. Detta system är ekonomiskt och bärbart för användarna. Den har två delar av plaströr-en för vattnet (innerdiameter, 8 mm) och en för perfusat (innerdiameter, 1,5 mm)-av vilken den distala änden är ansluten till en PE medicinsk trevägskran med ett Luer-lås. En glasflaska innehållande vatten och med en gummipropp bildar som värmeväxlare. Perfusatet pumpas in i plastslangen i värmeväxlaren av den peristaltiska pumpen och kommer ut från trevägskranen som är ansluten till kanylen. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2. Aorta och vävnader runt. En “Y”-formad blodkärlsstruktur är aortan och dess grenar: den brachiocephalic artären (pil 1) och den vänstra gemensamma halsartären (pil 2). Transect aorta mellan den vänstra gemensamma halsartären (grön linje) och samtidigt skära brachiocephalic gatan i vissa möss; transect vid den stigande aortan (svart linje) hos andra möss (stereomikroscope 10 × 2 förstoring). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3. Frontal utsikt över det kanylerade hjärtat. Den svarta böjda linjen representerar den incisal kanten av stora kroppspulsådern som var transected mellan den vänstra gemensamma halsartären. Den röda böjda linjen representerar aortas incisala kant som omvandlas vid den stigande stora kroppspulsådern. Den raka linjen representerar var aortan var ligerad: svart vid den stigande aortan och röd vid kolorektalroten (stereomikroscope 10 × 2 förstoring). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 4. Perfusionstillstånd i de kanylerade hjärtan. Förmaken är tillräckligt perfuserad, och båda förmaksbihangen blåses upp i hjärtat (A) kanyleras och ligeras vid den stigande aortan. Båda förmaksbihangen är dock wizened i hjärtat (B) kanyleras och ligated vid aorta roten, vilket indikerar dålig atria perfusion. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 5. Cell morfologi och livskraft utvärdering efter kalcium återintroduktion. AMs (A) och virtuella datorer (B) isolerade från hjärtat kanyleras och ligerade vid den stigande aortan representeras som AMAAs respektive VMAAs. AMs (C) och virtuella datorer (D) isolerade från hjärtat kanyleras och ligerade vid aorta roten representeras som AMARs respektive VMARs. Högkvalitativa CMs är quiescent och har intakta membran, tydliga konturer, tydliga strimmor sarkomerer och en slät cellyta. AMs är spindelformade, medan virtuella datorer är stav- eller tegelformade med rektangulära ändar. CMs som spontant drar ihop sig eller innehåller blebs i membranet är av dålig kvalitet, och de som krymper till en sfärisk form är döda celler. Ett slumpmässigt synfält (fluorescensmikroskop, 10 × 10 förstoring, skalstänger, 100 μm). AM = förmaks myocyt, VM = ventrikulär myocyt. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 6. Cellmorfologi under ett konfokalt mikroskop före och efter kalcium återintroduktion. Före kalcium återintroduktion är AMAA (A) och AMAR (C) spindelformade med tydliga konturer, strimmor sarkomer och släta membranytor. Efter kalcium återintroduktion är AMAA (B) och AMAR (D) också spindelformade med tydliga konturer, strimmor sarkomer och släta membranytor. Före kalcium återintroduktion är VMAA (E) och VMAR (G) stav- eller tegelformade med tydliga konturer, strimmig sarkomer och släta membranytor med rektangulära ändar. Efter kalcium återintroduktion är VMAA (F) och VMAR (H) också stav- eller tegelformade med tydliga konturer, strimmiga sarkomerer och släta membranytor med rektangulära ändar (konfokal mikroskopolja, 63 × 10 förstoring; skalstänger, 50 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 7. Bedömning av cellviabilitet. Skadade celler som förlorar aktivitet färgas av trypan blå. Däremot kan livskraftiga celler inte färgas av trypanblå (fluorescensmikroskop, 4 × 10 förstoring; skalstänger, 100 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 8. Stapeldiagram som visar överlevnads frekvensen för AMAA, AMAR, VMAA och VMAR före och efter kalcium återintroduktion. CR = kalcium återintroduktion. Varje värde representerar medelvärdet ± SD från 10 möss. p < 0,01. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Lösning Innehåll (slutlig koncentration i mmol/L, om det inte anges annorlunda) Jag förstår Perfusionslösning (lösning 1) 113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Taurin, 5 Glukos, 10 2,3-butanedione monoxime(BDM) Som kan förvaras i 3 dagar vid 4 °C. Glukos, taurin och BDM tillsätts på experimentdagen. Förbered 200 ml perfusionslösning för varje hjärta. Tyrlids lösning (lösning 2) 140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glukos Som kan förvaras i 3 dagar vid 4 °C. CaCl2 och Glukos läggs till på experimentdagen, justera pH till 7,3-7,4 med mättad NaOH vid rumstemperatur (28-30 °C) med en PH-mätare. Tabell 1. Lösningar för isolering av mus för vuxna mus. Lösning Innehåll Jag förstår Rötningslösning (lösning 3) 25 ml lösning 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg kollagenas II, 50μL (2,5 % 10×) trypsin för varje hjärta Stopplösning 1 (lösning 4) 9 ml lösning 1, 1 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 för varje hjärta Stopplösning 2 (lösning 5) 9,5 ml lösning 1, 0,5 mL FBS (Fetal Bovine Serum), 4μL 100 mM/L CaCl2 för varje hjärta Cell resuspension lösning(lösning 6) 13 ml lösning 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) vid en dos som kan bilda ett tunt skikt som täcker vätskans yta för varje hjärta Tabell 2. Lösningar för isolering och lagring av vuxna mus CM. Figur 9. Natriumkanalernas strömspänningskurvor. Helcell patch clamp tekniker användes för att registrera natrium strömmar av isolerade kardiomyocyter i spänning klämma läge. Spänningsklämmaprotokollet visas i infälld. Natriumströmmar som registrerats från AM (A) och VM (B) visas. Den nuvarande densiteten vid potentialer på −45mV, −40mV och −35 mV är betydligt högre i AM (−32,71 ± 1,597 pA/pF, −31,49 ± 1,820 pA/pF, −29,34 ± 1,939 pA/pF, n = 10) än i VM (−17,66 pA/pF ± 1,976 pA/pF, −21,09 ± 1,560 pA/pF och −21,86 ± 1,381 pA/pF, respektive n = 8; P < 0,05). (C) I-V-kurvorna visar den natriumströmtäthet som normaliserades till cellkapacitans. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 10. Förmakskärlets ursprung och distribution. Förmakskärlet (pil 1) och certifikatutfärdaren (pil 2) i panel A. Panel B är en närmare titt på förmakskärlet (pil 3). C) Det finns två ostia av olika storlek. den ena (pil 4) motsvarar det förmakskärl som bevattnade de förmaksbihangen och den andra (pil 5) motsvarar certifikatutfärdaren (stereomikroscope 10 × 5 förstoring). CA = kranskärl. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Mössens serienummer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Abtulationens djup är vid den stigande aortan 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7 Djupet av aorta cannulation är vid aorta roten 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0 Tabell 3. Avstånd från kanylspetsen till kranskärlssyten ostium. Hjärtat hos C57BL/6 möss (n = 20) användes för att kanylera och ligate aortan på djupet av den stigande stora kroppspulsådern respektive aortan. Aortan är anatomisk, och avståndet från kanylspetsen till CA-ostium mättes. Avståndet mäts i millimeter, och positiva eller negativa tecken representerar kanylspetsen ovanför respektive under CA-ostiumet.

Discussion

Single CM är ett värdefullt och oumbärligt verktyg i cellulära studier av hjärtfunktion och ^sjukdomar20. Därför är isoleringen av livskraftiga CMs från hjärtat det första och mest avgörande steget. Cellkvalitet är en av de viktigaste faktorerna för att genomföra framgångsrika experiment, särskilt i optiska och elektrofysiologiska experiment. Jämfört med CMs av andra djur är gnagare-CMs mer sårbara för ischemi och hypoxi på grund av en högre koncentration av intracellulära natriumjoner, vilket gynnar kalciumtillströmning genom Na ⁺/^{Ca2+ exchanger21}. Dessutom är antalet AMs mycket mindre än antalet virtuella datorer. Därför är det extremt svårt att uppnå en framgångsrik isolering. Langendorff-metoden är utmärkt för att isolera möss virtuella ^datorer22, men framgångsgraden för att isolera AMs är låg och få rapporter finns tillgängliga. Det korrekta djupet av aorta cannulation är också en viktig faktor för att ge idealiska virtuella datorer bortsett från temperatur, enzymaktivitet, PH och vattenkvalitet som används för buffertberedning. Principen av Langendorff metod relys på retrograd perfusion av hjärtan. Vid perfusion stängs aortaventilen; därmed tvingas perfusatet in i kranskärlen, levererar enzymlösning genom kärlgrenarna, och myokardvävnaden smälts jämnt. För att uppnå denna typ av cirkulationsmönster måste aortan reservera tillräckligt med längd för kanyl och ligatur, även kanylspetsen får inte tränga in i aortaventilerna eller blockera CA-ostiumet. Således är det rimligt att spekulera att djupet av aorta cannulation är också förknippat med atria perfusion, vilket påverkar matsmältningseffektiviteten hos atria och avkastningen av AM på ett liknande sätt. Protokollet som presenteras här bekräftade hypotesen, och avgörande steg för att optimera cellutbyte tillsammans med förslagen noteras nedan.

I steg 1.9, för att bättre säkra aortan, rekommenderas en trubbig 20 G kanyl med ett hack (eller ett omkretsspår) där avståndet är 1 mm till spetsen. Baserat på våra erfarenheter konstaterades kanylstorleken som är lite större än aortas diameter för att förhindra kanylspetsen från att punktera aortaventilerna under kanylen eftersom aortan, som förlitar sig på dess inneboende elasticitet, kan passa tätt in i kanylen och producera friktion, som fungerar som en skyddande faktor när man går framåt eller bakåt och justerar kanyldjupet. När det gäller skårans position kommer hjärtat lätt att glida av under kanylen på grund av gravitationen om det är för nära kanylspetsen. Omvänt kommer utrymmet för justering av kannulationsdjupet och ligaturpositionen att vara mycket begränsat om för långt. Med tanke på dessa omständigheter är transecting aorta mellan den vänstra gemensamma halsartären (som den gröna linjen i figur 2) för att säkerställa att aortan är tillräckligt lång och kanyleras och ligeras vid den stigande storaorten bättre i steg 3.3. Medan transecting vid den stigande aortan, den reserverade längden för kanyl åtminstone kan säkra kanylspetsen nära kolorektalroten och kommer inte att tränga in i kolorektalventilerna efter ligatur. Aortans anatomi och mätningen av avståndet från kanylspetsen till CA ostium indikerar att transecting av aortan mellan den vänstra gemensamma halsartären är en idealisk position för att uppnå ett korrekt aorta cannulation djup.

Cannulation djup konstaterades vara associerad med atria perfusion, som i sin tur fungerar som en djup indikator. Figur 4 visar att atria perfusion är bra när djupet är vid den stigande aortan, och båda förmaksbihangen är uppblåsta. Atria perfusion är dock otillräckligt när djupet är vid (eller närmar sig) den aorta roten och båda förmaksbihangen är wizened. Det totala och livskraftiga antalet am-avkastningar från de uppblåsta förmaksbihangen var högre (figur 8). Dessa resultat visar att aorta kannulation djup kan påverka perfusion och matsmältningen av förmaken och förmaksbihang på ett visst sätt och slutligen påverka AM avkastning och kvalitet. Avkastningen och kvaliteten på am-produkten drogs slutsatsen att den var förknippad med distributionen av de fartyg som levererar till förmaken. Studien av Fernández et ^al.23 har visat olika avvikelser i ursprunget och kursen för mus CA. De fann att CAs ostia var mycket varierande och inte alla var belägna i aorta sinus. Vissa CAs kan härstamma avvikande från ovanför de aorta bihålorna, som heter den höga start ostium. Vissa CAs kan komma från samma aorta sinus, och ostiumet på atriumfartyget ligger precis i närheten. Aortans anatomi i den aktuella studien (figur 10) överensstämmer också med fernández fynd. Detta kan vara orsaken till att försök att isolera AM med Langendorff-metoden till stor del har misslyckats om kannulationsdjupet inte är lämpligt. Således kommer kanylspetsen att ha större chans att blockera atriumkärlet ostium som ligger intill CA-ostiumet om det inte finns tillräckligt med utrymme mellan kanylspetsen och CA-ostiumet. Däremot påverkades perfusion och cellutbytet av ventrikeln knappast så länge aortaventilerna inte trängdes in av kanylspetsen. Detta beror förmodligen på att de CAs som levererar blod till ventrikeln har större ostia och mer ursprung. Om en ostium var ockluderad av kanylen, ventrikel perfusion kan kompenseras av en annan CA eller den säkerheter cirkulationen, medan blodkärlet som levererar atrium är ganska litet och har ingen ersättning. Således är djupets inflytande i aorta cannulation viktigt.

Andra anmärkningsvärda faktorer och problemskyttar i matsmältnings- och celllagringsprocessen listas enligt följande. Överväg först att persyrera syresatt Tyreds lösning i steg 4.1 för att få muskeln att dra ihop sig och pumpa ut kvarvarande blod om blodet i förmaken inte har rusats ut efter aorta ligatur. Detta kan bidra till att undvika den negativa effekten av ^ca2+ och andra material som frigörs från de skadade erytrocyterna. För det andra kan perfusing ^{ca2 +} fri lösning i förväg för att separera anslutningen och utöka utrymmet mellan celler förbättra effekten av enzym matsmältning eftersom intercalated diskar mellan CMs är kalciumberoende intercellulära korsningar. Tiden bör dock begränsas till 3-5 min för att undvika kalciumparadoxfenomenet24. En blandad enzymlösning rekommenderas. Kollagenas typ II stör det extracellulära matrisnätverket, och trypsin hjälper till att rensa det granulära materialet som finns kvar på cellytan om kollagenas II matsmältningen är ofullständig. Detta säkerställer en slät cellyta, vilket är avgörande för att bilda en GΩ-tätning i patchklämmans registrering. Trypsinkoncentrationen bör dock kontrolleras i rätt intervall för att undvika över matsmältning och cellskada eftersom det kan försämra membranproteinet. Att använda enbart kollagenas typ II för att förbättra cellutbytet kan ofta leda till vävnad över matsmältningen, och de isolerade CMs kommer att vara kalciumintoleranta efter långvarig ^{kollagenasexponering25}. Användningen av 2,3-butanedione monoxime (BDM), ett ämne som förhindrar spontan sammandragning genom att hämma myosin ATPase och förhindra korsbrobildning, är fortfarande kontroversiell26,27,28,29. Enligt tidigare erfarenhet är det nödvändigt att lägga till BDM för detta protokoll. Enzymlösningen framställs med lösning 1 även om lösning 1 inte innehåller kalcium, och kalcium tillsätts för att aktivera enzymet. Fördelen med att tillsätta BDM i perfusionslösningen inkluderar (1) hämmande av myocyterkontraktion och minskning av syreförbrukningen under enzymlösningsperfusion och (2) förhindra myocyter från hypoxi och förbättra kvaliteten på de isolerade myocyterna. Vissa studier rapporterade att BDM kan ha en potentiell negativ inverkan på cellulära elektriska egenskaper. Resultaten av hela cellen patch klämman inspelning av natriumströmmen indikerade dock inte en oönskad effekt. I celllagringssteget (steg 6) har många studier valt KB-bufferten, en kalciumfri men hög kaliumkoncentrationslösning, där celler kan upprätthålla ett bättre tillstånd eftersom de är i polariserade och låga metaboliska förhållanden. Cellmembranets glykocalyx kommer dock att separeras från lipidbilayern i avsaknad av exogent kalcium under en viss tid och membranets permeabilitet kommer att öka, vilket påverkar den efterföljande funktionella analysen30,31,32.

Alla myocytes isolering tekniker kan i huvudsak kategoriseras för närvarande i antingen bit (en liten bit vävnad) matsmältning i en enzymatisk lösning eller CA perfusion med enzymatisk lösning (Langendorff perfusion)²². Jämfört med Langendorff-metoden är bitrötningsmetoden lättare att utföra och används också rutinmässigt för att isolera CMs i många laboratorier. Denna metod ger dock normalt ett lågt utbyte av CMs av dålig kvalitet från vuxna ^vävnader22. Dessutom kan celler som isolerats med denna metod inte vara lämpliga för att utföra jämförande experiment. När du till exempel testar celltypspecifika läkemedelseffekter mellan AM och VM kan effekten av olika isoleringsförhållanden inte försummas eller uteslutas. Detta beror på att myokardiet och vävnadstätheten i ventrikeln är mycket tjockare och tätare än atriumets, vilket resulterar i olika matsmältningstider och enzymkoncentrationer. Dessutom kommer överdriven agitation och pipettering av vävnaden under matsmältningen att skada cellerna och avsevärt påverka funktionella studier. Dessutom har många tidigare studier visat att AMs är mer sårbara för kalcium. AMs isolerade av det nuvarande protokollet kan dock vara tolerant mot gradient kalcium återintroduktion förmodligen eftersom vävnaden är lätt att brista i slutet av matsmältningsprocessen. Således är mekanisk skada mindre, medan celler skulle drabbas av mer mekaniska skador eftersom steg i bitmetoden behöver upprepad bristning och centrifugal. Mer nyligen rapporterade Ackers et ^al.33 en förenklad, Langendorff-fri metod för isolering av livskraftiga hjärtmyocyter och nonmyocyter. De virtuella datorerna och fibroblaster kan effektivt isoleras, men mängden AMs nämndes inte. Detta protokoll har dock flera begränsningar. För det första kan fördelningen av hjärtblodkärlen ha variationer för individuella skillnader och mössstamning, och det rekommenderade kanonationsdjupet kan inte garantera en framgångsrik AMs-isolering för varje gång. För det andra, för dem som är nya i detta förfarande kan ta en viss tid att öva aorta transection och bakåtsträvande aorta cannulation. Slutligen testades denna metod inte i andra hjärtsjukdomsmodeller utom hos friska och äldre möss. Därför kommer det att kräva justeringar i enzymkoncentrationer och tid för matsmältningen på grund av hjärtats fibros utsträckning. Nackdelen med olika matsmältningsförhållanden som påträffas i chunk-metoden kommer inte att vara ett problem i Langendorff-metoden där enzymlösningen fördelas jämnt till vävnaden av kärlbäddarna.

Sammanfattningsvis har protokollen för samtidig isolering av enstaka AM och VM som beskrivs här visat att rätt aorta cannulation djup effektivt kan förbättra atrium perfusion och AM avkastning. De CMs som isoleras med denna metod är av hög kvalitet, har god kalciumtolerans och har framgångsrikt tillämpats på patchklämmaregistrering och kalciumhantering (^{Ca2 +} release och ^{Ca2 +} vågmätning av IonOptix-systemet) i ^teamet34. Det förväntas att isoleringsprotokollet kan användas för cellberedning i en serie cellulära och subcellulära undersökningar, vilket kommer att bidra till att fördjupa förståelsen av hjärtfysiologi och patologi. Viktigt är att det kommer att möjliggöra upptäckten av mer kliniskt relevanta hjärtsjukdomar mekanismer och interventionsmetoder.

Materials

2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)