Analys av lymfkörtelvolym av ultrahögfrekvent ultraljudsavbildning i Braf/Pten genetiskt konstruerad musmodell av melanom
Summary
Melanom är en mycket aggressiv sjukdom som snabbt sprider sig till andra organ. Detta protokoll beskriver tillämpningen av ultra-högfrekvent ultraljud imaging, tillsammans med 3D rendering, för att övervaka volymen av inguinallymfknutor lymfkörtlar i Braf/Pten mus modell av ögonbevarande melanom.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox genetiskt konstruerade möss (Braf/Pten möss) används ofta som en in vivo-modell av metastaserat melanom. När en primär tumör har framkallats av tamoxifenbehandling observeras en ökning av metastaserad börda inom 4-6 veckor efter induktion. Detta dokument visar hur Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging kan utnyttjas för att övervaka ökningen av metastaserad inblandning av de inguinallymfknutna lymfkörtlarna genom att mäta ökningen av deras volym.
UHFUS-systemet används för att skanna bedövade möss med en UHFUS linjär sond (22-55 MHz, axiell upplösning 40 μm). B-lägesbilder från de inguinallymfknutna lymfkörtlarna (både vänster och höger sida) förvärvas i en kortaxlig vy, placera djuren i dorsala recumbency. Ultraljudsjournaler förvärvas med hjälp av en stegstorlek på 44 μm på en motoriserad mekanisk arm. Efteråt importeras tvådimensionella (2D) B-läge förvärv till mjukvaruplattformen för ultraljud bild efterbehandling, och inguinallymfknutor lymfkörtlar identifieras och segmenteras semi-automatiskt i de förvärvade tvärsnitts 2D-bilderna. Slutligen erhålls en total rekonstruktion av den tredimensionella (3D) volymen automatiskt tillsammans med renderingen av lymfkörtelvolymen, som också uttrycks som en absolut mätning.
Denna icke-invasiva in vivo-teknik tolereras mycket väl och möjliggör schemaläggning av flera bildbehandlingssessioner på samma försöksdjur under 2 veckor. Det är därför idealiskt att bedöma effekten av farmakologisk behandling på metastaserad sjukdom.
Introduction
Melanom är en aggressiv form av hudcancer som ofta sprider sig till andra hudplatser (subkutana metastaser), liksom till lymfkörtlar, lungor, lever, hjärna och ben1. Under det senaste decenniet har nya läkemedel introducerats i klinisk praxis och har bidragit till att förbättra livslängden för metastaserande melanompatienter. Begränsningar kvarstår dock, inklusive variabel tid till och grad av svar, allvarliga biverkningar och uppror av förvärvad resistens1. Därför är det viktigt att upptäcka metastaserad spridning i dess tidiga skeden, det vill säga när det kommer till de lokala lymfkörtlarna.
En biopsi av de lokala lymfkörtlarna (sentinel lymfkörtlar) utförs vanligtvis för att kontrollera förekomsten av melanomceller. Ultraljud imaging håller dock på att få fäste som en icke-invasiv metod för att upptäcka ögonbevarande engagemang, eftersom det överträffar klinisk utvärdering och kan bidra till att undvika en onödig biopsi2,3,4. Dessutom verkar ultraljud imaging lämpligt för lymfkörteln övervakning, särskilt vid hög ålder och/eller samsjuklighet5,6. De funktioner som detekteras genom ultraljud analys och tillåter differentiering mellan normala och ögonbevarande lymfkörtlar omfattar ökad storlek (volym), förändring av form från oval till rund, oregelbunden marginal, förändrat ekogent mönster och förändrad (ökad) vaskulärisering7.
Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox genetiskt modifierade möss (Braf/Pten möss) har nyligen gjorts tillgängliga för forskarsamhället som en vävnadsspecifik och inducerbar modell för metastaserat melanom8. I denna djurmodell utvecklas primära tumörer mycket snabbt: de blir synliga inom 2-3 veckor efter induktion av övergången från wild-type (wt) Braf till BrafV600E och förlusten av Pten, medan de når en volym på 50-100 mm3 inom 4 veckor. Under de följande 2 veckorna åtföljs tillväxten av den primära tumören av en progressiv ökning av metastaserad börda i andra hudplatser, lymfkörtlar och lungor.
Braf/Pten möss har använts i stor utsträckning för flera ändamål, inklusive dissekering av signalvägar involverade i melanomgenes9,10, identifiering av melanomceller av ursprung11,12,13 och testning av nya terapeutiska alternativ när det gäller både riktad terapi och immunterapi8,14,15,16 . Specifikt använde vi Braf/Pten möss för att visa att försvagade Listeria monocytogenes (Lmat) fungerar som ett anti-melanom vaccin. När det administreras systemiskt i den terapeutiska inställningen är Lmat inte associerad med övergripande toxicitet eftersom den selektivt ackumuleras på tumör platser. Dessutom orsakar det en anmärkningsvärd minskning av primär melanom massa och en minskning av metastaserad börda i lymfkörtlar och lungor. På molekylär nivå orsakar Lmat apoptotisk avlivning av melanomceller, vilket åtminstone delvis beror på icke-cell-autonoma aktiviteter (rekrytering på plats av CD4+ och CD8 + T lymfocyter)16.
När Braf/Pten möss används för melanom modellering, tillväxten av primära tumörer och subkutana metastaser kan övervakas av caliper mätningar. Lymfkörtlarnas och lungornas inblandning måste dock undersökas med hjälp av en alternativ teknik, möjligen en icke-invasiv teknik som gör det möjligt för forskare att följa samma djur över tid. Detta dokument beskriver användningen av ultraljud imaging (figur 1), tillsammans med en efterföljande 3D volymetrisk analys av erhållna data, för longitudinell övervakning av ökningen av storlek (volym) av inguinallymfknutor lymfkörtlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
De data som erhålls i denna studie intygar förmågan av ultraljud imaging att övervaka den metastaserande medverkan av inguinallymfknutor lymfkörtlar i Braf/Pten mus modell av metastaserad melanom. Som visats tidigare16 är denna teknik särskilt användbar för att bedöma effekten av läkemedelsbehandling. Detta beror på att det gör det möjligt att övervaka förändringen i lymfkörtelvolymen hos samma djur över tiden, genom att jämföra de mätningar som samlats in vid t1 <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka S. Burchielli (FTGM, Pisa) för hennes hjälp med djurprocedurer. Detta arbete stöddes av ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionell finansiering till LP; MFAG #17095 tilldelas av AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro till LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
Referências
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
