Analyse av lymfeknutervolum ved ultra-høyfrekvent ultralydavbildning i Braf / Pten genetisk konstruert musemodell av melanom
Summary
Melanom er en veldig aggressiv sykdom som raskt sprer seg til andre organer. Denne protokollen beskriver anvendelsen av ultra-høyfrekvent ultralydavbildning, kombinert med 3D-gjengivelse, for å overvåke volumet av inguinale lymfeknuter i Braf / Pten-musemodellen av metastatisk melanom.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genmodifiserte mus (Braf/Pten mus) er mye brukt som en in vivo modell av metastatisk melanom. Når en primærsvulst har blitt indusert ved tamoksifenbehandling, observeres en økning i metastatisk byrde innen 4-6 uker etter induksjon. Dette dokumentet viser hvordan Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) avbildning kan utnyttes for å overvåke økningen i metastatisk involvering av inguinale lymfeknuter ved å måle økningen i volumet.
UHFUS-systemet brukes til å skanne bedøvede mus med en UHFUS lineær sonde (22-55 MHz, aksial oppløsning 40 μm). B-modus bilder fra inguinale lymfeknuter (både venstre og høyre side) er anskaffet i en kortaksevisning, og plasserer dyrene i dorsal recumbency. Ultralydposter er anskaffet ved hjelp av en trinnstørrelse på 44 μm på en motorisert mekanisk arm. Etterpå importeres todimensjonale (2D) B-modus-oppkjøp til programvareplattformen for ultralydbilde etter behandling, og inguinale lymfeknuter identifiseres og segmenteres halvautomatisk i de oppkjøpte tverrsnitts 2D-bildene. Til slutt oppnås en total rekonstruksjon av det tredimensjonale (3D) volumet automatisk sammen med gjengivelsen av lymfeknutevolumet, som også uttrykkes som en absolutt måling.
Denne ikke-invasive in vivo-teknikken tolereres veldig godt og tillater planlegging av flere bildebehandlingsøkter på samme eksperimentelle dyr over 2 uker. Det er derfor ideelt å vurdere effekten av farmakologisk behandling på metastatisk sykdom.
Introduction
Melanom er en aggressiv form for hudkreft som ofte sprer seg til andre hudsteder (subkutane metastaser), samt til lymfeknuter, lunger, lever, hjerne og bein1. I løpet av det siste tiåret har nye legemidler blitt introdusert i klinisk praksis og har bidratt til å forbedre forventet levetid for metastatiske melanompasienter. Imidlertid forblir begrensninger, inkludert variabel tid til og grad av respons, alvorlige bivirkninger og opprøret av ervervet motstand1. Derfor er det avgjørende å oppdage metastatisk spredning i sine tidlige stadier, det vil si når det kommer til de lokale lymfeknuter.
En biopsi av de lokale lymfeknuter (sentinel lymfeknuter) utføres vanligvis for å sjekke om det finnes melanomceller. Imidlertid tar ultralydavbildning tak som en ikke-invasiv metode for å oppdage metastatisk involvering, da det overgår klinisk evaluering og kan bidra til å unngå en unødvendig biopsi2,3,4. Videre synes ultralydavbildning hensiktsmessig for lymfeknuteovervåking, spesielt når det gjelder avansert alder og / eller komorbiditeter5,6. Funksjonene som oppdages ved ultralydanalyse og tillater differensiering mellom normale og metastatiske lymfeknuter, består av økt størrelse (volum), endring av form fra oval til rund, uregelmessig margin, endret ekkogent mønster og endret (økt) vaskularisering7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk konstruerte mus (Braf/Pten mus) har nylig blitt gjort tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet som en vevsspesifikk og indusert modell for metastatisk melanom8. I denne dyremodellen utvikler primære svulster veldig raskt: de blir synlige innen 2-3 uker etter induksjonen av bryteren fra wild-type (wt) Braf til BrafV600E og av tapet av Pten, mens de når et volum på 50-100 mm3 innen 4 uker. I de følgende 2 ukene er veksten av den primære svulsten ledsaget av en progressiv økning i metastatisk byrde i andre hudsteder, lymfeknuter og lunger.
Braf/Pten-mus har blitt mye brukt til flere formål, inkludert disseksjonen av signalveier involvert i melanomagenese9,10, identifisering av melanomceller av opprinnelse11,12,13, og testing av nye terapeutiske alternativer når det gjelder både målrettet terapi og immunterapi8,14,15,16 . Spesielt brukte vi Braf/Pten mus for å demonstrere at svekkede Listeria monocytogenes (Lmat) fungerer som en anti-melanom vaksine. Når det administreres systemisk i terapeutisk setting, er Lmat ikke forbundet med generell toksisitet, da det selektivt akkumuleres på tumorsteder. Videre forårsaker det en bemerkelsesverdig nedgang i primær melanommasse og en reduksjon i metastatisk byrde i lymfeknuter og lunger. På molekylært nivå forårsaker Lmat apoptotisk drap på melanomceller, noe som i det minste delvis skyldes ikke-celle-autonome aktiviteter (rekruttering på stedet av CD4 + og CD8 + T lymfocytter)16.
Når Braf/Pten-mus brukes til melanommodellering, kan veksten av primære svulster og subkutane metastaser overvåkes av kalipermålinger. Imidlertid må involvering av lymfeknuter og lunger undersøkes ved hjelp av en alternativ teknikk, muligens en ikke-invasiv som gjør det mulig for forskere å følge samme dyr over tid. Dette dokumentet beskriver bruken av ultralydavbildning (figur 1), kombinert med en påfølgende 3D-volumetrisk analyse av de oppnådde dataene, for langsgående overvåking av økningen i størrelse (volum) av inguinale lymfeknuter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dataene som er oppnådd i denne studien, vitner om evnen til ultralydavbildning for å overvåke metastatisk involvering av inguinale lymfeknuter i Braf / Pten-musemodellen av metastatisk melanom. Som vist tidligere16, er denne teknikken spesielt nyttig for å vurdere effekten av narkotikabehandling. Dette er fordi det tillater overvåking av endringen i lymfeknutevolumet i samme dyr over tid, ved å sammenligne målingene samlet på t1 andt2 med de som samles in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke S. Burchielli (FTGM, Pisa) for hennes hjelp med dyreprosedyrer. Dette arbeidet ble støttet av ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institusjonell finansiering til LP; MFAG #17095 tildelt av AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
Referências
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
