RNA 测序的三种微分表达分析方法：利马、边缘、DESeq2
Summary
提供了RNA测序的微分表达分析方法的详细协议：伽利马、EdgeR、DESeq2。
Abstract
RNA测序（RNA-seq）是转录学中最广泛使用的技术之一，因为它可以揭示基因改变与复杂的生物过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后和治疗方面具有重要价值。RNA-seq 数据的微分分析对于识别异常转录至关重要，而 limma、EdgeR 和 DESeq2 是微分分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在此，我们提供详细的协议，以确定胆管癌 （CHOL） 和正常组织之间通过伽马， DESeq2 和 EdgeR 的差异表达基因 （DEG）， 结果在火山地块和维恩图中显示。伽马、DESeq2 和 EdgeR 这三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，线性模型用于伽马体的统计，而负二元分布用于边缘R和DESeq2。此外，正常化的RNA-seq计数数据对于 EdgeR 和 limma 是必要的，但对于 DESeq2 来说不是必要的。
在这里，我们为三种微分分析方法提供了详细的协议：伽利马、EdgeR 和 DESeq2。这三种方法的结果是部分重叠的。这三种方法都有各自的优势，方法的选择只取决于数据。
Introduction
RNA测序（RNA-seq）是转录学中应用最广泛的技术之一，具有许多优点（例如，高数据可重复性），并极大地增进了我们对复杂生物过程1、2的功能和动力学的理解。在不同的生物背景下识别异常记录（也称为微分表达基因 ）是RNA-seq分析的关键步骤。RNA-seq 使深入了解发病机制相关的分子机制和生物功能成为可能。因此，差异分析被认为是有价值的诊断，预后和治疗肿瘤3，4，5。目前，更多的开源R/生物导体包已经开发为RNA-seq差分表达分析，特别是利马，DESeq2和EdgeR 1，6，7。然而，差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在本协议中，根据从癌症基因组图集 （TCGA） 中提取的胆管癌 （CHOL） RNA-seq 计数数据，R 程序11分别执行了三种最已知的方法（limma8、EdgeR9和 DESeq210），以确定 CHOL 和正常组织之间的 DEG。伽马、EdgeR 和 DESeq2 的三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，EdgeR 和 limma8、9需要规范化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则使用自己的库差异来更正数据，而不是校正10。此外，edgeR 特别适用于 RNA-seq 数据，而 limma 则用于微阵列和 RNA-seq。Limma 采用线性模型来评估 DEG12，而 edgeR 中的统计数据基于负二元分布，包括经验贝叶估计、精确测试、通用线性模型和准可能性测试9。
总之，我们分别使用 limma、DESeq2 和 EdgeR 提供 RNA-seq 差分表达分析的详细协议。通过引用本文，用户可以轻松地执行 RNA-seq 差分分析，并为其数据选择适当的差分分析方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
丰富的癌症异常记录可以通过RNA-seq差分分析5轻松识别。但是，RNA-seq 差分表达分析的应用往往受到限制，因为它需要具有某些 R 语言技能和选择适当方法的能力。为了解决这个问题，我们提供了三种最已知的方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细介绍，以及应用 RNA-seq 差分表达分析的教程。这将促进理解所有三种方法的相似性和差异，使选择适合单个数据的方法，并使我们能够了解…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（81860276号赠款）和国家重点研发计划重点专项资金项目（2018YFC1003200号赠款）的支持。
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