CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi
Summary
Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.
Abstract
Beyin aktivitesi, nöronlar arasında geçen elektrokimyasal sinyaller, nöronal ağların bağlantı kalıpları ve bu nöronlar içindeki süreçlerin ve alt yapıların morfolojisi tarafından belirlenir. Bu nedenle, beyin fonksiyonu hakkında bilinenlerin çoğu, nöronların beyinde nasıl organize olduğu ve bağlandığı hakkında daha fazla fikir veren görüntüleme teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra ortaya çıkmıştır. Doku temizlemedeki gelişmeler, kalın beyin dilimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine, morfolojik rekonstrüksiyonun ve dendritik çardaklar ve dikenler gibi nöronal alt yapıların analiz edilmesine izin sağlamaktadır. Birlikte, görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, büyük görüntüleme veri kümelerini hızlı bir şekilde analiz etme yöntemleri sağlar. Bu çalışma, CLARITY doku temizleme, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi kullanarak etiketli sinir dokusunun kalın dilimlerini yüksek çözünürlükte işlemek, görselleştirmek ve analiz etmek için nispeten hızlı bir yöntem sunar. Bu protokol, sağlıklı beyinleri karakterize eden bağlantı kalıplarını ve nöronal morfolojileri ve hastalıklı beyin durumlarında ortaya çıkan bu özelliklerdeki değişiklikleri anlama çabalarını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Karmaşık üç boyutlu biyolojik yapıların mekansal organizasyonun, bağlantı kalıplarının ve morfolojisinin anlaşılması, belirli hücrelerin ve dokuların işlevlerini sınırlandırmak için gereklidir. Bu, özellikle merkezi sinir sisteminin yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalarını oluşturmaya adanmış muazzam çabanın bulunduğu nörobilimde geçerlidir1,2. Bu haritaları oluşturan nöronların yakından incelenmesi, bu çeşitli nöron setlerinin işlevini yansıtan bağlantılar ve konumlar ile çeşitli morfolojiler verir3,4. Ayrıca, subselüler yapıların, özellikle dendritik dikenlerin araştırılması, sinapsların olgunluğunu bilgilendirebilir, böylece gelişimsel süreçleri ve nörolojik hastalık durumlarını yansıtabilir5,6,7. Bu nedenle, görüntüleme çözünürlüğünü ve verimini artıran yaklaşımlar, beyin fonksiyonlarını her ölçekte daha iyi anlamak için gereklidir.
Son gelişmeler, nöron popülasyonlarını işaretlemek ve manipüle etmek için moleküler ve genetik araç setini genişletti. Yeni floresan belirteçlerin geliştirilmesi, bu belirteçleri nöronlara sokmanın yeni yöntemleriyle birlikte, aynı hayvan veya beyin örneği 8 ,9,10,11içindeki etkileşime giren nöron popülasyonlarının diferansiyel etiketlenerek etiketlenerek. Işık opak lipitler tarafından dağıldığı için ve beyin dokusunun yüksek lipid içeriği göz önüne alındığında, görüntüleme nöronal popülasyonları öncelikle ince bölümlerle sınırlıdır veya derin yapıları görüntülemek için gelişmiş mikroskropsi tekniklerine (örneğin, konfokal, çoklu foton ve ışık tabakası mikroskopisi) güvenmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar doku temizleme tekniklerindeki gelişmelerle büyük ölçüde desteklenmiştir. Berrak Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Sert Görüntüleme / immünostaining /yerinde melezleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY), ilgi çekici dokuların hidrojel monomerler (akrilamid ve bis-akrilamid) ile aşılanması ve daha sonra deterjanlarla yıkanması12. Hidrojel monomerler, optik olarak şeffaf ve makromolekül etiketlere geçirgen kararlı bir 3D hidrojel iskele oluşturmak için melezleşir. Nükleik asitler ve proteinler melezleştirilmiş matris içinde tutulurken, lipitler deterjan yıkamaları ile çıkarılır (Şekil 1). Bu, hücrelerin ve lipid olmayan moleküllerin orijinal şeklini ve yönünü koruyacak kadar sert, optik olarak ise derin yapıları yüksek çözünürlükte kolayca görüntüleyece kadar optik olarak şeffaf olan kararlı bir doku ile sonuçlanır. Doku yapısının ve oryantasyonunun bu şekilde korunması, kalın dilimlerin görüntülenmesini sağlar, böylece hücreden hücreye bağlantıları ve mekansal ilişkileri korur. Ayrıca, temizleme işlemi sırasında proteinlerin ve nükleik asitlerin yeri ve mevcudiyeti korunduğu için, temizlenmiş dokular ekspresyon bazlı belirteçlerin yanı sıra eksojen etiketleri de tutabilir. Böylece CLARITY, büyük miktarda derin beyin yapılarını ve bu yapılar arasındaki bağlantıları yüksek çözünürlükte görüntülemek için güçlü bir yöntem olarak kendini ödünç verir.
CLARITY kullanımı, nöronal popülasyonları görüntüleme yaklaşımlarını büyük ölçüde geliştirir. Bu teknik özellikle büyük miktarda görüntüleme verisi oluşturmada ustadır. CLARITY, birden fazla protein bazlı floresan formuyla iyi çalışır. Bu protokol, EGFP ve tdTomato ile seyrek etiket hücrelerine lentiviral tabanlı bir yaklaşım kullanır; bununla birlikte, tdTomato veya EGFP’yi rekonstrüksiyon için hücreleri etiketlemek için ifade eden transgenik muhabir alelleri rutin olarak kullanılmıştır. Hem fotoğrafa kararlı hem de parlak bir florofor seçmek önemlidir (örneğin, EGFP veya tdTomato). Ayrıca, floroforu ifade etmek için güçlü bir promotör kullanmak üstün kontrast ve görüntü kalitesi verir. Bu tekniğin dezavantajları, bu büyük miktarda verinin düzgün bir şekilde analiz edilmesi hem emek hem de zaman yoğun olabileceği için ortaya çıkar. Özel mikroskoplar verimi artırmaya ve iş yükünü azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, gelişmiş mikroskopların inşası, sahibi ve/veya işletilmeleri birçok laboratuvar için genellikle maliyet-yasaklayıcıdır. Bu çalışma, standart konfokal mikroskopi ile birlikte büyük bölümlerin CLARITY doku temizlemesini kullanarak yüksek çözünürlükte büyük miktarlarda sinir dokusunu görselleştirmek için yüksek verim, nispeten hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu protokol bu yaklaşımı aşağıdaki adımlarla açıklar: 1) sinir dokusunun parçalanması ve hazırlanması, 2) dokunun temizlenmesi, 3) dokunun montajı, 4) hazırlanan dilimlerin görüntülenmesi ve 5) mikroskopi görselleştirme yazılımı rekonstrüksiyonu ve analizi kullanılarak tam dilim görüntülerin işlenmesi (Şekil 2). Bu çabalar, nöron popülasyonlarını, nöronal bağlantı modellerini, 3D dendritik morfolojiyi, dendritik omurga bolluğunu ve morfolojisini ve sağlam beyin dokusu içindeki moleküler ifade kalıplarını analiz etmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çağdaş doku temizleme tekniklerinin ortaya çıkmasından önce, nöronal morfolojinin incelenmesi zaman yoğun kesitleme, görüntüleme ve bitişik çok ince bölümlerin yeniden yapılandırılmasından oluşuyordu. Konfokal görüntüleme ile birlikte elektroforetik doku temizlemenin kullanılması, tam nöronal morfolojinin engelsiz bir görünümünü sağlar. Bozulmamış dendritik ağaçlardan, en küçük sinaptik bouton’a kadar, nöronal morfolojiyi görüntülemek ve ölçmek hiç bu kadar mümkün olmamı?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jan ve Dan Duncan Nöroloji Enstitüsü’ndeki viral çekirdek NRDDC’ye bu deneylerde kullanılan AAV’leri ve lentivirüsleri ürettikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine’a fare hayvancılığı ve kullanılan farelerin genel bakımı için teşekkür ederiz. Amerikan Kalp Derneği’ne 20PRE35040011 ödül numarası altında verdikleri destek için ve BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists (PJH) için teşekkür ederiz. Son olarak, logos’a laboratuvarımıza Logos X-Clarity elektroforetik doku temizleme sistemini sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
Referências
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genética. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
