Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing
Summary
La morfología dendrítica neuronal a menudo subyace a la función. De hecho, muchos procesos de enfermedad que afectan el desarrollo de las neuronas se manifiestan con un fenotipo morfológico. Este protocolo describe un método simple y poderoso para analizar cenadores dendríticos intactos y sus espinas asociadas.
Abstract
La actividad cerebral, las señales electroquímicas pasadas entre las neuronas, está determinada por los patrones de conectividad de las redes neuronales y por la morfología de los procesos y subestructuras dentro de estas neuronas. Como tal, gran parte de lo que se sabe sobre la función cerebral ha surgido junto con los desarrollos en tecnologías de imágenes que permiten una mayor comprensión de cómo las neuronas están organizadas y conectadas en el cerebro. Las mejoras en la limpieza de tejidos han permitido imágenes de alta resolución de cortes gruesos de cerebro, facilitando la reconstrucción morfológica y el análisis de subestructuras neuronales, como cenadores dendríticos y espinas. En conjunto, los avances en el software de procesamiento de imágenes proporcionan métodos para analizar rápidamente grandes conjuntos de datos de imágenes. Este trabajo presenta un método relativamente rápido de procesamiento, visualización y análisis de rebanadas gruesas de tejido neural etiquetado a alta resolución utilizando la limpieza de tejidos CLARITY, la microscopía confocal y el análisis de imágenes. Este protocolo facilitará los esfuerzos para comprender los patrones de conectividad y las morfologías neuronales que caracterizan a los cerebros sanos, y los cambios en estas características que surgen en los estados cerebrales enfermos.
Introduction
Comprender la organización espacial, los patrones de conectividad y la morfología de estructuras biológicas tridimensionales complejas es esencial para delinear las funciones de células y tejidos específicos. Esto es especialmente cierto en neurociencia, en la que se ha dedicado un tremendo esfuerzo a construir mapas neuroanatómicos de alta resolución del sistema nervioso central1,2. El examen detallado de las neuronas que componen estos mapas arroja morfologías variadas, con conexiones y ubicaciones que reflejan la función de estos diversos conjuntos de neuronas3,4. Además, la investigación de las estructuras subcelulares, especialmente las espinas dendríticas, puede informar la madurez de las sinapsis, reflejando así los procesos de desarrollo y los estados de enfermedad neurológica5,6,7. Por lo tanto, los enfoques que mejoran la resolución y el rendimiento de las imágenes son esenciales para comprender mejor la función cerebral en todas las escalas.
Los avances recientes han ampliado el conjunto de herramientas moleculares y genéticas para marcar y manipular poblaciones de neuronas. El desarrollo de nuevos marcadores fluorescentes, combinado con nuevos métodos de introducción de estos marcadores en las neuronas, permite el etiquetado diferencial de poblaciones de neuronas que interactúan dentro de la misma muestra animal o cerebral8,9,10,11. Debido a que la luz es dispersada por lípidos opacos, y dado el alto contenido de lípidos del tejido cerebral, las poblaciones neuronales de imágenes se han limitado principalmente a secciones delgadas o se han basado en técnicas avanzadas de microescropia (por ejemplo, microscopía confocal, multiprofónica y de lámina de luz) para obtener imágenes de estructuras profundas. Sin embargo, estos esfuerzos se han visto reforzados en gran medida por los avances en las técnicas de limpieza de tejidos. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) es una de esas técnicas, en la que los tejidos de interés se infunden con monómeros de hidrogel (acrilamida y bis-acrilamida) y luego se lavan con detergentes12. Los monómeros de hidrogel se hibridan para crear un andamio de hidrogel 3D estable que es ópticamente transparente y permeable a las etiquetas de macromoléculas. Los ácidos nucleicos y las proteínas se mantienen dentro de la matriz hibridada, mientras que los lípidos se eliminan mediante los lavados de detergente (Figura 1). Esto da como resultado un tejido estable que es lo suficientemente rígido como para mantener la forma y orientación originales de las células y las moléculas no lipídicas, mientras que ópticamente lo suficientemente transparente como para obtener fácilmente imágenes de estructuras profundas a alta resolución. Este mantenimiento de la estructura y orientación del tejido permite la obtención de imágenes de rodajas gruesas, preservando así las conexiones de célula a célula y las relaciones espaciales. Además, debido a que la ubicación y disponibilidad de proteínas y ácidos nucleicos se mantiene durante el proceso de limpieza, los tejidos despejados pueden contener marcadores basados en la expresión, así como etiquetas exógenas. Por lo tanto, CLARITY se presta como un método potente para obtener imágenes de grandes cantidades de estructuras cerebrales profundas y las conexiones entre estas estructuras a alta resolución.
El uso de CLARITY mejora en gran medida los enfoques para obtener imágenes de poblaciones neuronales. Esta técnica es especialmente experta en generar grandes cantidades de datos de imágenes. CLARITY funciona bien con múltiples formas de fluorescencia a base de proteínas. Este protocolo utiliza un enfoque basado en lentivirales para etiquetar escasamente las células con EGFP y tdTomato; sin embargo, los alelos reporteros transgénicos que expresan tdTomato o EGFP para etiquetar las células para la reconstrucción se han utilizado rutinariamente. Es importante elegir un fluoróforo que sea fotoestablo y brillante (por ejemplo, EGFP o tdTomato). Además, el uso de un promotor fuerte para expresar el fluoróforo produce un contraste y una calidad de imagen superiores. Los inconvenientes de esta técnica surgen ya que analizar adecuadamente esta gran cantidad de datos puede ser laborioso y requiere mucho tiempo. Los microscopios especializados pueden ayudar a mejorar el rendimiento y disminuir la carga de trabajo. Sin embargo, construir, poseer y / u operar microscopios avanzados a menudo son prohibitivos para muchos laboratorios. Este trabajo presenta un método de alto rendimiento, relativamente rápido y simple para visualizar grandes cantidades de tejido neural a alta resolución utilizando la limpieza de tejidos CLARITY de grandes secciones, combinada con microscopía confocal estándar. Este protocolo describe este enfoque a través de los siguientes pasos: 1) diseccionar y preparar el tejido neural, 2) limpiar el tejido, 3) montar el tejido, 4) obtener imágenes de las rebanadas preparadas y 5) procesar imágenes de cortes completos utilizando la reconstrucción y el análisis del software de visualización de microscopía(Figura 2). Estos esfuerzos dan como resultado imágenes de alta resolución que se pueden usar para analizar poblaciones de neuronas, patrones de conexión neuronal, morfología dendrítica 3D, abundancia y morfología de la columna vertebral dendrítica y patrones de expresión molecular dentro del tejido cerebral intacto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes del advenimiento de las técnicas contemporáneas de limpieza de tejidos, el estudio de la morfología neuronal consistía en seccionamientos intensivos en tiempo, imágenes y reconstrucción de secciones adyacentes muy delgadas. El uso de la limpieza electroforética del tejido en combinación con imágenes confocales proporciona una visión sin obstáculos de la morfología neuronal completa. Desde árboles dendríticos intactos, hasta el bouton sináptico más pequeño, la obtención de imágenes y la cuantifica…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al núcleo viral NRDDC en el Instituto Neurológico Jan y Dan Duncan por producir los AAV y lentivirus utilizados en estos experimentos. Además, nos gustaría agradecer al Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine por la cría de ratones y el mantenimiento general de los ratones utilizados. Nos gustaría agradecer a la Asociación Americana del Corazón por su apoyo bajo el número de premio 20PRE35040011, y BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists por su apoyo (PJH). Finalmente, nos gustaría agradecer a Logos por proporcionar a nuestro laboratorio el sistema de limpieza de tejido electroforético Logos X-Clarity.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
Referências
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