Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose
Summary
Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.
Abstract
Schlaganfall ist eine der häufigsten Todesursachen und erworbene Behinderungen bei Erwachsenen in industrieländern Ländern. Trotz umfangreicher Untersuchungen nach neuartigen Therapiestrategien gibt es nach wie vor begrenzte Therapiemöglichkeiten für Schlaganfallpatienten. Daher ist mehr Forschung für pathophysiologische Wege wie Entzündungen nach einem Schlaganfall, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration erforderlich. Angesichts der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die Komplexität des Gehirns zu reproduzieren, sind experimentelle Schlaganfallmodelle für die Analyse und anschließende Bewertung neuartiger Wirkstoffziele für diese Mechanismen unerlässlich. Darüber hinaus werden dringend detaillierte standardisierte Modelle für alle Verfahren benötigt, um die sogenannte Replikationskrise zu überwinden. Als Versuch innerhalb des ImmunoStroke-Forschungskonsortiums wird ein standardisiertes photothrombotisches Mausmodell mit einer intraperitonealen Injektion von Rose Bengal und der Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser beschrieben. Dieses Modell ermöglicht die Durchführung von Schlaganfällen bei Mäusen mit Zuordnung zu jeder kortikalen Region des Gehirns ohne invasive Operation; Dies ermöglicht die Untersuchung von Schlaganfällen in verschiedenen Bereichen des Gehirns. In diesem Video werden die chirurgischen Methoden der Schlaganfallinduktion im photothrombotischen Modell zusammen mit der histologischen Analyse demonstriert.
Introduction
Ischämischer Schlaganfall bleibt eine der Hauptursachen für Todesfälle und erworbene Erwachsene Behinderung in den Entwickelten Ländern im 21. Jahrhundert, die für etwa 2,7 Millionen Todesfälle im Jahr 2017 weltweitverantwortlich sind 1. Trotz der immensen Anstrengungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft sind nur wenige Behandlungen verfügbar. Darüber hinaus sind diese bereits begrenzten Optionen bei solch hohen Ausschlusskriterien für viele Patienten nicht zugänglich, was zu einem dringenden Bedarf an neuartigen Behandlungen zur Verbesserung der funktionellen Genesung nach einem Schlaganfall führt.
In Anbetracht der Unfähigkeit von In-vitro-Modellen, die komplexen Interaktionen des Gehirns zu replizieren, sind Tiermodelle für die präklinische Schlaganfallforschung unerlässlich. Mäuse sind das am häufigsten verwendete Tiermodell in der Schlaganfallforschung. Die Mehrheit dieser Mausmodelle zielt darauf ab, Infarkte zu induzieren, indem sie den Blutfluss innerhalb der mittleren Hirnarterie (MCA) blockieren, da sich die Mehrheit der menschlichen Schlaganfallläsionen im MCA-Territorium befindet2. Obwohl diese Modelle menschliche Schlaganfallläsionen besser rekapitulieren, beinhalten sie konvulierte Operationen mit hoher Infarktvolumenvariabilität.
Seit Rosenblum und El-Sabbans Vorschlag des photothrombotischen Modells im Jahr 19773und später die Anwendung dieses Modells auf Ratten Watson et al.4ist es in der ischämischen Schlaganfallforschung weit verbreitet5,6. Das photothrombotische Schlaganfallmodell induziert einen lokalen und definierten kortikalen Infarkt als Folge der Photoaktivierung eines lichtempfindlichen Farbstoffs, der zuvor in den Blutfluss injiziert wurde. Dies führt zu einer lokalen Thrombose der Gefäße in den lichtexponierten Bereichen. Kurz gesagt, bei Einwirkung von Licht aus dem injizierten lichtempfindlichen Farbstoff wird eine lokalisierte oxidative Verletzung der Endothelzellmembran induziert, die zu Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung führt, gefolgt von einer lokalen Störung des zerebralen Blutflusses7.
Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit der Ausführung und der Möglichkeit, die Läsion in die gewünschte Region zu lenken. Im Gegensatz zu anderen experimentellen Schlaganfallmodellen ist für die Durchführung des photothrombotischen Schlaganfallmodells ein geringes chirurgisches Fachwissen erforderlich, da die Läsion durch Beleuchtung des intakten Schädels induziert wird. Darüber hinaus können die gut abgegrenzten Grenzen (Abbildung 2A und Abbildung 5B) und die Flexibilität, die Läsion zu einer bestimmten Hirnregion zu induzieren, die Untersuchung zellulärer Reaktionen innerhalb des ischämischen oder intakten kortikalen Bereichs erleichtern8. Aus diesen Gründen eignet sich dieser Ansatz zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der kortikalen Plastizität.
In den letzten Jahrzehnten wurde die wachsende Sorge um die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen Forschungsgruppen als sogenannte Replikationskrisegeprägt 9. Nach der Koordination der ersten präklinischen randomisierten kontrollierten multizentrischen Studie im Jahr 201510, einem vorgeschlagenen Instrument zur Verbesserung der präklinischen Forschung11,12,13, wurde bestätigt, dass eine Ursache für die mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen präklinischen Studien aus unabhängigen Labors die fehlende ausreichende Standardisierung experimenteller Schlaganfallmodelle und Ergebnisparameter war14. Als das ImmunoStroke-Konsortium (https://immunostroke.de/) gegründet wurde, eine Zusammenarbeit, die darauf abzielt, gehirn-immune Interaktionen zu verstehen, die den mechanistischen Prinzipien der Schlaganfall-Genesung zugrunde liegen, war die Standardisierung aller experimentellen Schlaganfallmodelle zwischen jeder Forschungsgruppe unerlässlich.
Hier wird das standardisierte Verfahren zur Induktion des photothrombotischen Modells beschrieben, wie es im oben genannten Forschungskonsortium verwendet wird. Kurz gesagt, ein Tier wurde einer Betäubung unterzogen, erhielt eine Rose Bengal Injektion (10 μL / g) intraperitonal, und der intakte Schädel, 3 mm von Bregma übrig, wurde sofort von einem 561 nm Laser für 20 min beleuchtet (Abbildung 1). Zusätzlich wird über eine verwandte histologische und verhaltensbezogene Methode zur Analyse des Schlaganfallergebnisses in diesem Modell berichtet. Alle Methoden basieren auf Standardarbeitsanweisungen, die im Labor entwickelt und verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt das experimentelle Schlaganfallmodell der Photothrombose durch Beleuchtung des intakten Schädels mit einem 561-nm-Laser mit einer vorherigen intraperitonealen Injektion von Rose Bengal. Bis vor kurzem war die Verwendung dieses Modells gering, nimmt aber stetig zu.
Die Mortalität während der Schlaganfallinduktion ist in diesem Modell nicht vorhanden. Die Gesamtmortalität von weniger als 5% entsteht während der Operation aufgrund anästhesiologischer Ko…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Kooperationspartnern der Immunostroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) für Anregungen und Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie deutschlands im Rahmen des Münchner Clusters für Systemeeurologie (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) und im Rahmen der Stipendien LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 und LL-112/1-1 gefördert.
Materials
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
Referências
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