Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Summary

Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l’occlusione microvascolare permanente utilizzando l’illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.

Abstract

L’ictus è una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Nonostante un’ampia indagine per nuove strategie terapeutiche, rimangono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con ictus. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per i percorsi fisiopatologici come l’infiammazione post-ictus, l’angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Data l’incapacità dei modelli in vitro di riprodurre la complessità del cervello, i modelli sperimentali di ictus sono essenziali per l’analisi e la successiva valutazione di nuovi bersagli farmacologici per questi meccanismi. Inoltre, sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure per superare la cosiddetta crisi della replica. Come sforzo all’interno del consorzio di ricerca ImmunoStroke, viene descritto un modello murino fototrombotico standardizzato che utilizza un’iniezione intraperitoneale di Rose Bengal e l’illuminazione del cranio intatto con un laser a 561 nm. Questo modello consente l’esecuzione di ictus nei topi con allocazione a qualsiasi regione corticale del cervello senza chirurgia invasiva; quindi, consentendo lo studio dell’ictus in varie aree del cervello. In questo video, vengono dimostrati i metodi chirurgici di induzione dell’ictus nel modello fototrombotico insieme all’analisi istologica.

Introduction

L’ictus ischemico rimane una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati nel 21^° secolo, rappresentando circa 2,7 milioni di morti nel 2017 in tutto il mondo¹. Anche con gli immensi sforzi della comunità scientifica, sono disponibili pochi trattamenti. Inoltre, con criteri di esclusione così elevati, queste opzioni già limitate non sono accessibili a molti pazienti, con conseguente urgente necessità di nuovi trattamenti per migliorare il recupero funzionale dopo l’ictus.

Considerando l’incapacità dei modelli in vitro di replicare le complesse interazioni del cervello, i modelli animali sono essenziali per la ricerca preclinica sull’ictus. I topi sono il modello animale più frequentemente utilizzato nel campo della ricerca sull’ictus. La maggior parte di questi modelli murini mira a indurre infarti bloccando il flusso sanguigno all’interno dell’arteria cerebrale media (MCA) poiché la maggior parte delle lesioni umane da ictus si trova nel territorio MCA². Sebbene questi modelli ricapitolino meglio le lesioni umane dell’ictus, coinvolgono interventi chirurgici convulsi con elevata variabilità del volume dell’infarto.

Dalla proposta di Rosenblum e El-Sabban del modello fototrombotico nel 1977 3 , e successivamente^{l’applicazione}di questo modello ai ratti Watson et al.⁴, è diventato ampiamente utilizzato nella ricerca^sull’ictusischemico 5^,6. Il modello di ictus fototrombotico induce un infarto corticale locale e definito a seguito della fotoattivazione di un colorante sensibile alla luce precedentemente iniettato nel flusso sanguigno. Ciò causa trombosi locale dei vasi nelle aree esposte alla luce. In breve, dopo l’esposizione alla luce del colorante fotosensibile iniettato, viene indotta una lesione ossidativa localizzata della membrana cellulare endoteliale, che porta all’aggregazione piastrinica e alla formazione di trombi, seguita da un’interruzione locale del flusso sanguigno cerebrale⁷.

Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua semplicità di esecuzione e nella possibilità di dirigere la lesione verso la regione desiderata. A differenza di altri modelli sperimentali di ictus, è necessaria una minore esperienza chirurgica per eseguire il modello di ictus fototrombotico poiché la lesione viene indotta attraverso l’illuminazione del cranio intatto. Inoltre, i bordi ben delimitati(Figura 2A e Figura 5B)e la flessibilità di indurre la lesione in una specifica regione del cervello possono facilitare lo studio delle risposte cellulari all’interno dell’area corticale ischemica o intatta^8. Per questi motivi, questo approccio è adatto per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari della plasticità corticale.

Negli ultimi decenni, la crescente preoccupazione per la mancanza di riproducibilità tra i gruppi di ricerca è stata coniata la cosiddetta crisi di replicazione⁹. Dopo il coordinamento del primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico nel 2015^10,uno strumento proposto per migliorare la ricerca preclinica^11,12,13,è stato confermato che una delle cause della mancata riproducibilità tra studi preclinici di laboratori indipendenti era la mancanza di una sufficiente standardizzazione dei modelli sperimentali di ictus e dei parametri di esito^14. Di conseguenza, quando è stato istituito il consorzio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una collaborazione che mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell’ictus, la standardizzazione di tutti i modelli sperimentali di ictus tra ciascun gruppo di ricerca era essenziale.

Qui è descritta la procedura standardizzata per l’induzione del modello fototrombotico utilizzata nel suddetto consorzio di ricerca. In breve, un animale è stato sottoposto ad anestesia, ha ricevuto un’iniezione di Rose Bengal (10 μL / g) per via intraperitonale e il cranio intatto, a 3 mm dalla bregma, è stato immediatamente illuminato da un laser a 561 nm per 20 minuti (Figura 1). Inoltre, viene riportato un metodo istologico e comportamentale correlato per analizzare l’esito dell’ictus in questo modello. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard sviluppate e utilizzate in laboratorio.

Protocol

Gli esperimenti riportati in questo video sono stati condotti secondo le linee guida nazionali per l’uso di animali da esperimento e i protocolli sono stati approvati dai comitati governativi tedeschi (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). I topi utilizzati in questo studio erano topi maschi C57Bl / 6J, di 10-12 settimane, e inviati da Charles River Germany. Gli animali sono stati alloggiati a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C), con un ciclo luce-buio di 12 ore e accesso a cibo e acqua pellet…

Representative Results

Il modello qui descritto è un modello di corsa fototrombotica mediante iniezione rose bengala e illuminazione del cranio intatta per 20 minuti, a una lunghezza d’onda costante di 561 nm e una potenza di uscita di 25 mW alla fibra. Sebbene la chirurgia fototrombotica completa duri 30 minuti, l’animale è tenuto in anestesia bassa e il danno cerebrale è moderato. Circa 10 minuti dopo il trasferimento nelle loro gabbie, tutti gli animali erano svegli, si muovevano liberamente nella gabbia e interagivano con i compagni di …

Discussion

Il protocollo presentato descrive il modello sperimentale di ictus della fototrombosi illuminando il cranio intatto con un laser a 561 nm, con una precedente iniezione intraperitoneale di Rose Bengal. Fino a poco tempo fa, l’uso di questo modello è stato basso ma è in costante aumento.

La mortalità durante l’induzione dell’ictus in questo modello è assente. La mortalità complessiva inferiore al 5% si manifesta durante l’operazione a causa di complicazioni anestesiologiche o sacrifici dopo…

Materials

561 nm wavelenght laser	Solna	Cobolt HS-03
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100
Bepanthen pomade	Bayer	1578681
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Collimeter	Thorlabs	F240APC-A
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filter paper	Macherey-Nagel	432018
Fine Scissors	FST	15000-00
Forceps	FST	11616-15
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller	40-90-8D
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle	Perimed	PeriCam PSI HR
Mayor Scissors	FST	1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Protective glasses	Laser 2000	NIR-ZS2-38
Rose Bengal	Sigma Aldrich	198250-5G
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Stereotactic frame	Stoelting	51500U
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Xylacine	Albrecht