Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l’occlusione microvascolare permanente utilizzando l’illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.
L’ictus è una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati. Nonostante un’ampia indagine per nuove strategie terapeutiche, rimangono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con ictus. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per i percorsi fisiopatologici come l’infiammazione post-ictus, l’angiogenesi, la plasticità neuronale e la rigenerazione. Data l’incapacità dei modelli in vitro di riprodurre la complessità del cervello, i modelli sperimentali di ictus sono essenziali per l’analisi e la successiva valutazione di nuovi bersagli farmacologici per questi meccanismi. Inoltre, sono urgentemente necessari modelli standardizzati dettagliati per tutte le procedure per superare la cosiddetta crisi della replica. Come sforzo all’interno del consorzio di ricerca ImmunoStroke, viene descritto un modello murino fototrombotico standardizzato che utilizza un’iniezione intraperitoneale di Rose Bengal e l’illuminazione del cranio intatto con un laser a 561 nm. Questo modello consente l’esecuzione di ictus nei topi con allocazione a qualsiasi regione corticale del cervello senza chirurgia invasiva; quindi, consentendo lo studio dell’ictus in varie aree del cervello. In questo video, vengono dimostrati i metodi chirurgici di induzione dell’ictus nel modello fototrombotico insieme all’analisi istologica.
L’ictus ischemico rimane una delle principali cause di morte e disabilità acquisita negli adulti nei paesi sviluppati nel 21° secolo, rappresentando circa 2,7 milioni di morti nel 2017 in tutto il mondo1. Anche con gli immensi sforzi della comunità scientifica, sono disponibili pochi trattamenti. Inoltre, con criteri di esclusione così elevati, queste opzioni già limitate non sono accessibili a molti pazienti, con conseguente urgente necessità di nuovi trattamenti per migliorare il recupero funzionale dopo l’ictus.
Considerando l’incapacità dei modelli in vitro di replicare le complesse interazioni del cervello, i modelli animali sono essenziali per la ricerca preclinica sull’ictus. I topi sono il modello animale più frequentemente utilizzato nel campo della ricerca sull’ictus. La maggior parte di questi modelli murini mira a indurre infarti bloccando il flusso sanguigno all’interno dell’arteria cerebrale media (MCA) poiché la maggior parte delle lesioni umane da ictus si trova nel territorio MCA2. Sebbene questi modelli ricapitolino meglio le lesioni umane dell’ictus, coinvolgono interventi chirurgici convulsi con elevata variabilità del volume dell’infarto.
Dalla proposta di Rosenblum e El-Sabban del modello fototrombotico nel 1977 3 , e successivamentel’applicazionedi questo modello ai ratti Watson et al.4, è diventato ampiamente utilizzato nella ricercasull’ictusischemico 5,6. Il modello di ictus fototrombotico induce un infarto corticale locale e definito a seguito della fotoattivazione di un colorante sensibile alla luce precedentemente iniettato nel flusso sanguigno. Ciò causa trombosi locale dei vasi nelle aree esposte alla luce. In breve, dopo l’esposizione alla luce del colorante fotosensibile iniettato, viene indotta una lesione ossidativa localizzata della membrana cellulare endoteliale, che porta all’aggregazione piastrinica e alla formazione di trombi, seguita da un’interruzione locale del flusso sanguigno cerebrale7.
Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua semplicità di esecuzione e nella possibilità di dirigere la lesione verso la regione desiderata. A differenza di altri modelli sperimentali di ictus, è necessaria una minore esperienza chirurgica per eseguire il modello di ictus fototrombotico poiché la lesione viene indotta attraverso l’illuminazione del cranio intatto. Inoltre, i bordi ben delimitati(Figura 2A e Figura 5B)e la flessibilità di indurre la lesione in una specifica regione del cervello possono facilitare lo studio delle risposte cellulari all’interno dell’area corticale ischemica o intatta8. Per questi motivi, questo approccio è adatto per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari della plasticità corticale.
Negli ultimi decenni, la crescente preoccupazione per la mancanza di riproducibilità tra i gruppi di ricerca è stata coniata la cosiddetta crisi di replicazione9. Dopo il coordinamento del primo studio preclinico randomizzato controllato multicentrico nel 201510,uno strumento proposto per migliorare la ricerca preclinica11,12,13,è stato confermato che una delle cause della mancata riproducibilità tra studi preclinici di laboratori indipendenti era la mancanza di una sufficiente standardizzazione dei modelli sperimentali di ictus e dei parametri di esito14. Di conseguenza, quando è stato istituito il consorzio ImmunoStroke (https://immunostroke.de/), una collaborazione che mira a comprendere le interazioni cervello-immunità alla base dei principi meccanicistici del recupero dell’ictus, la standardizzazione di tutti i modelli sperimentali di ictus tra ciascun gruppo di ricerca era essenziale.
Qui è descritta la procedura standardizzata per l’induzione del modello fototrombotico utilizzata nel suddetto consorzio di ricerca. In breve, un animale è stato sottoposto ad anestesia, ha ricevuto un’iniezione di Rose Bengal (10 μL / g) per via intraperitonale e il cranio intatto, a 3 mm dalla bregma, è stato immediatamente illuminato da un laser a 561 nm per 20 minuti (Figura 1). Inoltre, viene riportato un metodo istologico e comportamentale correlato per analizzare l’esito dell’ictus in questo modello. Tutti i metodi si basano su procedure operative standard sviluppate e utilizzate in laboratorio.
Il protocollo presentato descrive il modello sperimentale di ictus della fototrombosi illuminando il cranio intatto con un laser a 561 nm, con una precedente iniezione intraperitoneale di Rose Bengal. Fino a poco tempo fa, l’uso di questo modello è stato basso ma è in costante aumento.
La mortalità durante l’induzione dell’ictus in questo modello è assente. La mortalità complessiva inferiore al 5% si manifesta durante l’operazione a causa di complicazioni anestesiologiche o sacrifici dopo…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo tutti i nostri partner di collaborazione dei Consorzi Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) per suggerimenti e discussioni. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell’ambito della strategia di eccellenza della Germania nell’ambito del Cluster for Systems Neurology di Monaco (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) e nell’ambito delle sovvenzioni LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 e LL-112/1-1.
561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Xylacine | Albrecht |