Modelleringsslag hos mus: Brennvide kortikale lesjoner ved fototrombose

Summary

Beskrevet her er den fototrombotiske slagmodellen, hvor et slag produseres gjennom den intakte skallen ved å indusere permanent mikrovaskulær okklusjon ved hjelp av laserbelysning etter administrering av et lysfølsomt fargestoff.

Abstract

Hjerneslag er en ledende dødsårsak og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land. Til tross for omfattende undersøkelse for nye terapeutiske strategier, er det fortsatt begrensede terapeutiske alternativer for slagpasienter. Derfor er det behov for mer forskning for patofysiologiske veier som post-slag betennelse, angiogenese, nevronal plastisitet og regenerering. Gitt intromodellenes manglende evne til å reprodusere kompleksiteten i hjernen, er eksperimentelle slagmodeller avgjørende for analyse og etterfølgende evaluering av nye legemiddelmål for disse mekanismene. I tillegg er detaljerte standardiserte modeller for alle prosedyrer presserende nødvendig for å overvinne den såkalte replikeringskrisen. Som et forsøk innen ImmunoStroke forskningskonsortium beskrives en standardisert fototrombotisk musemodell ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal og belysningen av den intakte skallen med en 561 nm laser. Denne modellen tillater ytelsen av slag hos mus med tildeling til enhver kortikale region i hjernen uten invasiv kirurgi; dermed muliggjør studiet av hjerneslag i ulike områder av hjernen. I denne videoen demonstreres de kirurgiske metodene for slaginduksjon i den fototrombotiske modellen sammen med histologisk analyse.

Introduction

Iskemisk hjerneslag er fortsatt en hovedårsak til døden og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land i det^21. Selv med den enorme innsatsen fra det vitenskapelige samfunnet, er det få behandlinger tilgjengelig. Videre, med så høye eksklusjonskriterier, er disse allerede begrensede alternativene ikke tilgjengelige for mange pasienter, noe som resulterer i et presserende behov for nye behandlinger for å forbedre funksjonell utvinning etter hjerneslag.

Tatt i betraktning incapability av in vitro modeller for å gjenskape de komplekse interaksjonene i hjernen, er dyremodeller avgjørende for preklinisk slagforskning. Mus er den mest brukte dyremodellen i slagforskningsfeltet. De fleste av disse musemodellene tar sikte på å indusere infarkt ved å blokkere blodstrømmen i den midterste hjernearterien (MCA) siden flertallet av menneskelige slaglesjoner ligger i MCA-territoriet². Selv om disse modellene bedre rekapitulerer menneskelige slaglesjoner, innebærer de kramper med høy infarktvolumvariabilitet.

Siden Rosenblum og El-Sabbans forslag til fototrombotisk modell i 1977³, og senere anvendelsen av denne modellen til rotter Watson et al.⁴, har den blitt mye brukt i iskemisk slagforskning^5,6. Den fototrombotiske slagmodellen induserer en lokal og definert kortikale infarkt som følge av fotoaktivering av et lysfølsomt fargestoff som tidligere ble injisert i blodstrømmen. Dette forårsaker lokal trombose av karene i områdene utsatt for lys. Kort sagt, ved eksponering for lys fra det injiserte lysfølsomme fargestoffet, induseres lokalisert oksidativ skade på endotelcellemembranen, noe som fører til blodplateaggregasjon og trombedannelse, etterfulgt av lokal forstyrrelse av hjerneblodstrømmen⁷.

Den viktigste fordelen med denne teknikken ligger i sin enkelhet i utførelsen og muligheten til å lede lesjonen til ønsket region. I motsetning til andre eksperimentelle slagmodeller, er det nødvendig med mindre kirurgisk ekspertise for å utføre den fototrombotiske slagmodellen da lesjonen induseres gjennom belysning av den intakte skallen. Videre kan de godt avgrensede grensene ( figur 2A og figur 5B) og fleksibiliteten til å indusere lesjonen til en bestemt hjerneregion lette studiet av cellulære responser innenfor det iskemiske eller intakte kortikale området⁸. Av disse grunnene er denne tilnærmingen egnet for studiet av cellulære og molekylære mekanismer for kortikale plastisitet.

I løpet av de siste tiårene har den økende bekymringen for mangelen på reproduserbarhet mellom forskningsgrupper blitt laget den såkalte replikeringskrisen⁹. Etter koordineringen av den første prekliniske randomiserte kontrollerte multisenterstudien i 2015¹⁰, et foreslått verktøy for å forbedre preklinisk forskning^11,12,13, ble det bekreftet at en årsak til sviktende reproduserbarhet mellom prekliniske studier fra uavhengige laboratorier var mangelen på tilstrekkelig standardisering av eksperimentelle slagmodeller og utfallsparametere¹⁴. Følgelig, da ImmunoStroke-konsortiet ble etablert (https://immunostroke.de/), et samarbeid som tar sikte på å forstå hjerneimmune interaksjoner som ligger til grunn for de mekanistiske prinsippene for hjerneslaggjenoppretting, var standardiseringen av alle eksperimentelle slagmodeller blant hver forskningsgruppe avgjørende.

Beskrevet her er den standardiserte prosedyren for induksjon av den fototrombotiske modellen som brukes i det ovennevnte forskningskonsortiet. Kort sagt, et dyr gjennomgikk bedøvelse, fikk en Rose Bengal injeksjon (10 μL / g) intraperitonalt, og den intakte skallen, 3 mm igjen fra bregma, ble umiddelbart opplyst av en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). I tillegg rapporteres en relatert histologisk og atferdsmessig metode for å analysere slagresultatet i denne modellen. Alle metoder er basert på standard driftsprosedyrer utviklet og brukt i laboratoriet.

Protocol

Forsøkene som ble rapportert i denne videoen ble utført i henhold til de nasjonale retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr, og protokollene ble godkjent av de tyske regjeringskomiteene (Regierung von Oberbayern, München, Tyskland). Musene som ble brukt i denne studien var mannlige C57Bl/6J-mus, 10-12 uker gamle, og sendt av Charles Germany. Dyrene ble plassert under kontrollerte temperaturer (22 °C ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk syklusperiode og tilgang til pelletert mat og vann ad libitum.</p…

Representative Results

Modellen beskrevet her er en fototrombotisk slagmodell av Rose Bengal injeksjon og intakt hodeskallebelysning i 20 min, ved en konstant 561 nm bølgelengde og 25 mW utgangseffekt ved fiberen. Selv om den komplette fototrombotiske operasjonen varer 30 min, holdes dyret under lav anestesi og hjerneskaden er moderat. Omtrent 10 min etter overføring til burene var alle dyrene våken, beveger seg fritt i buret og samhandler med kullkamerater. Infarkt ble utført ved hjelp av cresylfiolett farget s…

Discussion

Den presenterte protokollen beskriver den eksperimentelle slagmodellen for fototrombose ved å belyse den intakte skallen med en 561 nm laser, med en tidligere intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal. Inntil nylig har bruken av denne modellen vært lav, men øker stadig.

Dødelighet under hjerneslaginduksjon i denne modellen er fraværende. Den totale dødeligheten på mindre enn 5% oppstår under drift på grunn av anestesiologiske komplikasjoner eller offer etter å ha møtt eksklusjonskrit…

Materials

561 nm wavelenght laser	Solna	Cobolt HS-03
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit	Millipore	S7100
Bepanthen pomade	Bayer	1578681
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Collimeter	Thorlabs	F240APC-A
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filter paper	Macherey-Nagel	432018
Fine Scissors	FST	15000-00
Forceps	FST	11616-15
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller	40-90-8D
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Speckle	Perimed	PeriCam PSI HR
Mayor Scissors	FST	1410-15
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Protective glasses	Laser 2000	NIR-ZS2-38
Rose Bengal	Sigma Aldrich	198250-5G
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Stereotactic frame	Stoelting	51500U
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Xylacine	Albrecht