Beskrevet her er den fototrombotiske slagmodellen, hvor et slag produseres gjennom den intakte skallen ved å indusere permanent mikrovaskulær okklusjon ved hjelp av laserbelysning etter administrering av et lysfølsomt fargestoff.
Hjerneslag er en ledende dødsårsak og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land. Til tross for omfattende undersøkelse for nye terapeutiske strategier, er det fortsatt begrensede terapeutiske alternativer for slagpasienter. Derfor er det behov for mer forskning for patofysiologiske veier som post-slag betennelse, angiogenese, nevronal plastisitet og regenerering. Gitt intromodellenes manglende evne til å reprodusere kompleksiteten i hjernen, er eksperimentelle slagmodeller avgjørende for analyse og etterfølgende evaluering av nye legemiddelmål for disse mekanismene. I tillegg er detaljerte standardiserte modeller for alle prosedyrer presserende nødvendig for å overvinne den såkalte replikeringskrisen. Som et forsøk innen ImmunoStroke forskningskonsortium beskrives en standardisert fototrombotisk musemodell ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal og belysningen av den intakte skallen med en 561 nm laser. Denne modellen tillater ytelsen av slag hos mus med tildeling til enhver kortikale region i hjernen uten invasiv kirurgi; dermed muliggjør studiet av hjerneslag i ulike områder av hjernen. I denne videoen demonstreres de kirurgiske metodene for slaginduksjon i den fototrombotiske modellen sammen med histologisk analyse.
Iskemisk hjerneslag er fortsatt en hovedårsak til døden og ervervet voksen funksjonshemming i utviklede land i det21. Selv med den enorme innsatsen fra det vitenskapelige samfunnet, er det få behandlinger tilgjengelig. Videre, med så høye eksklusjonskriterier, er disse allerede begrensede alternativene ikke tilgjengelige for mange pasienter, noe som resulterer i et presserende behov for nye behandlinger for å forbedre funksjonell utvinning etter hjerneslag.
Tatt i betraktning incapability av in vitro modeller for å gjenskape de komplekse interaksjonene i hjernen, er dyremodeller avgjørende for preklinisk slagforskning. Mus er den mest brukte dyremodellen i slagforskningsfeltet. De fleste av disse musemodellene tar sikte på å indusere infarkt ved å blokkere blodstrømmen i den midterste hjernearterien (MCA) siden flertallet av menneskelige slaglesjoner ligger i MCA-territoriet2. Selv om disse modellene bedre rekapitulerer menneskelige slaglesjoner, innebærer de kramper med høy infarktvolumvariabilitet.
Siden Rosenblum og El-Sabbans forslag til fototrombotisk modell i 19773, og senere anvendelsen av denne modellen til rotter Watson et al.4, har den blitt mye brukt i iskemisk slagforskning5,6. Den fototrombotiske slagmodellen induserer en lokal og definert kortikale infarkt som følge av fotoaktivering av et lysfølsomt fargestoff som tidligere ble injisert i blodstrømmen. Dette forårsaker lokal trombose av karene i områdene utsatt for lys. Kort sagt, ved eksponering for lys fra det injiserte lysfølsomme fargestoffet, induseres lokalisert oksidativ skade på endotelcellemembranen, noe som fører til blodplateaggregasjon og trombedannelse, etterfulgt av lokal forstyrrelse av hjerneblodstrømmen7.
Den viktigste fordelen med denne teknikken ligger i sin enkelhet i utførelsen og muligheten til å lede lesjonen til ønsket region. I motsetning til andre eksperimentelle slagmodeller, er det nødvendig med mindre kirurgisk ekspertise for å utføre den fototrombotiske slagmodellen da lesjonen induseres gjennom belysning av den intakte skallen. Videre kan de godt avgrensede grensene ( figur 2A og figur 5B) og fleksibiliteten til å indusere lesjonen til en bestemt hjerneregion lette studiet av cellulære responser innenfor det iskemiske eller intakte kortikale området8. Av disse grunnene er denne tilnærmingen egnet for studiet av cellulære og molekylære mekanismer for kortikale plastisitet.
I løpet av de siste tiårene har den økende bekymringen for mangelen på reproduserbarhet mellom forskningsgrupper blitt laget den såkalte replikeringskrisen9. Etter koordineringen av den første prekliniske randomiserte kontrollerte multisenterstudien i 201510, et foreslått verktøy for å forbedre preklinisk forskning11,12,13, ble det bekreftet at en årsak til sviktende reproduserbarhet mellom prekliniske studier fra uavhengige laboratorier var mangelen på tilstrekkelig standardisering av eksperimentelle slagmodeller og utfallsparametere14. Følgelig, da ImmunoStroke-konsortiet ble etablert (https://immunostroke.de/), et samarbeid som tar sikte på å forstå hjerneimmune interaksjoner som ligger til grunn for de mekanistiske prinsippene for hjerneslaggjenoppretting, var standardiseringen av alle eksperimentelle slagmodeller blant hver forskningsgruppe avgjørende.
Beskrevet her er den standardiserte prosedyren for induksjon av den fototrombotiske modellen som brukes i det ovennevnte forskningskonsortiet. Kort sagt, et dyr gjennomgikk bedøvelse, fikk en Rose Bengal injeksjon (10 μL / g) intraperitonalt, og den intakte skallen, 3 mm igjen fra bregma, ble umiddelbart opplyst av en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). I tillegg rapporteres en relatert histologisk og atferdsmessig metode for å analysere slagresultatet i denne modellen. Alle metoder er basert på standard driftsprosedyrer utviklet og brukt i laboratoriet.
Den presenterte protokollen beskriver den eksperimentelle slagmodellen for fototrombose ved å belyse den intakte skallen med en 561 nm laser, med en tidligere intraperitoneal injeksjon av Rose Bengal. Inntil nylig har bruken av denne modellen vært lav, men øker stadig.
Dødelighet under hjerneslaginduksjon i denne modellen er fraværende. Den totale dødeligheten på mindre enn 5% oppstår under drift på grunn av anestesiologiske komplikasjoner eller offer etter å ha møtt eksklusjonskrit…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle våre samarbeidspartnere i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Fra immunceller til hjerneslaggjenoppretting) for forslag og diskusjoner. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy innenfor rammen av München Cluster for Systems Neurology (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) og under tilskuddene LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 og LL-112/1-1.
561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
Forceps | FST | 11616-15 | |
Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
Isoflurane | Abbot | B506 | |
Isopentane | Fluka | 59070 | |
Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
Saline solution | Braun | 131321 | |
Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Xylacine | Albrecht |