Modelleringsslag hos möss: Fokala kortikala lesioner genom fotokrobtik
Summary
Beskrivs här är den fototrobiska stroke modellen, där en stroke produceras genom den intakta skallen genom att inducera permanent mikrovaskulär ocklusion med laser belysning efter administrering av ett ljuskänsligt färgämne.
Abstract
Stroke är en ledande dödsorsak och förvärvad vuxen funktionsnedsättning i utvecklade länder. Trots omfattande undersökning för nya terapeutiska strategier, det finns fortfarande begränsade terapeutiska alternativ för stroke patienter. Därför behövs mer forskning för patofysiologiska vägar som inflammation efter stroke, angiogenes, neuronal plasticitet och regenerering. Med tanke på in vitro-modellernas oförmåga att reproducera hjärnans komplexitet är experimentella strokemodeller avgörande för analys och efterföljande utvärdering av nya läkemedelsmål för dessa mekanismer. Dessutom behövs det snabbt detaljerade standardiserade modeller för alla procedurer för att övervinna den så kallade replikeringskrisen. Som ett försök inom ImmunoStroke forskningskonsortium beskrivs en standardiserad fotothrombotic mus modell med en intraperitoneal injektion av Rose Bengal och belysningen av den intakta skallen med en 561 nm laser. Denna modell möjliggör prestanda av stroke hos möss med tilldelning till någon när region i hjärnan utan invasiv kirurgi; således, vilket möjliggör studier av stroke i olika delar av hjärnan. I denna video demonstreras de kirurgiska metoderna för stroke induktion i den fototrobotiska modellen tillsammans med histologiska analys.
Introduction
Ischemisk stroke är fortfarande en huvudorsak till dödsfall och förvärvade vuxna funktionshinder i utvecklade länder på 2000-talet som står för cirka 2,7 miljoner dödsfall under 2017 överhela världen 1. Även med det vetenskapliga samfundets enorma ansträngningar finns det få behandlingar tillgängliga. Dessutom, med så höga uteslutningskriterier, är dessa redan begränsade alternativ inte tillgängliga för många patienter, vilket resulterar i ett brådskande behov av nya behandlingar för att förbättra funktionell återhämtning efter stroke.
Med tanke på in vitro-modellernas oförmåga att replikera hjärnans komplexa interaktioner är djurmodeller viktiga för preklinisk strokeforskning. Möss är den vanligaste djurmodellen inom strokeforskningsområdet. Majoriteten av dessa musmodeller syftar till att inducera hjärtinfarkt genom att blockera blodflödet inom den mellersta cerebrala artären (MCA) eftersom majoriteten av mänskliga strokeskador ligger i MCA-territoriet2. Även om dessa modeller bättre rekapitulera mänskliga stroke organskador, de innebär convulated operationer med hög infarkt volym variabilitet.
Sedan Rosenblum och El-Sabbans förslag om den fototrobakbotiska modellen 19773, och senare tillämpningen av denna modell på råttor Watson et al.4, har den blivit allmänt använd i ischemisk strokeforskning5,6. Den fototrokrobotiska strokemodellen inducerar en lokal och definierad när infarkt som ett resultat av fotoaktivering av ett ljuskänsligt färgämne som tidigare injicerats i blodflödet. Detta orsakar lokal trombos hos kärlen i de områden som utsätts för ljus. Kort, vid exponering för ljus från det injicerade ljuskänsliga färgämnet, induceras lokaliserad oxidativ skada i endotelcellmembranet, vilket leder till trombocytaggregering och trombbildning, följt av lokala störningar av cerebralt blodflöde7.
Den främsta fördelen med denna teknik ligger i dess enkelhet av utförande och möjligheten att rikta lesion till önskad region. Till skillnad från andra experimentella strokemodeller behövs mindre kirurgisk expertis för att utföra den fototromobotiska strokemodellen eftersom lesion induceras genom belysning av den intakta skallen. Dessutom kan de väl avgränsade gränserna ( figur 2A och figur 5B) och flexibiliteten att inducera lesionen till en specifik hjärnregion underlätta studier av cellulära svar inom det ischemiska eller intakta närområdet8. Av dessa skäl är detta tillvägagångssätt lämpligt för studier av cellulära och molekylära mekanismer för när plasticitet.
Under de senaste decennierna har den växande oron för bristen på reproducerbarhet mellan forskargrupper myntats den så kallade replikeringskrisen9. Efter samordningen av den första prekliniska randomiserade kontrollerade multicenterstudiestudien 201510, ett föreslaget verktyg för att förbättra prekliniskforskning 11,12,13, bekräftades det att en orsak till bristande reproducerbarhet mellan prekliniska studier från oberoende laboratorier var bristen på tillräcklig standardisering av experimentella strokemodeller och utfallsparametrar14. När immunostrokekonsortiet inrättades (https://immunostroke.de/), ett samarbete som syftar till att förstå hjärnimmuna interaktioner som ligger till grund för de mekanistiska principerna för strokeåterhämtning, var standardiseringen av alla experimentella strokemodeller bland varje forskargrupp därför nödvändig.
Beskrivs här är det standardiserade förfarandet för induktion av den fototrokrobotiska modellen som används i ovannämnda forskningskonsortium. Kort, ett djur genomgick bedövningsmedel, fick en Rose Bengal injektion (10 μL/g) intraperitonally, och den intakta skallen, 3 mm kvar från bregma, belystes omedelbart av en 561 nm laser i 20 min (Figur 1). Dessutom rapporteras en relaterad histologisk och beteendemässig metod för att analysera stroke resultatet i denna modell. Alla metoder är baserade på standardrutiner som utvecklats och använts i laboratoriet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver den experimentella strokemodellen av fotothrombosis genom att belysa den intakta skallen med en 561 nm laser, med en tidigare intraperitoneal injektion av Rose Bengal. Fram till nyligen har användningen av denna modell varit låg men ökar stadigt.
Dödlighet under stroke induktion i denna modell är frånvarande. Den totala dödligheten på mindre än 5% uppstår under drift på grund av anestesiologiska komplikationer eller uppoffring efter uppfyllande…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla våra samarbetspartners i Immunostroke Consortia (FOR 2879, Från immunceller till strokeåterhämtning) för förslag och diskussioner. Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG,German Research Foundation) inom ramen för Tysklands excellensstrategi inom ramen för Münchenklustret för systemneurologi (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) och inom ramen för bidragen LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 och LL-112/1-1.
Materials
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
Referências
- GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1151-1210 (2017).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro Therapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circulation Research. 40 (3), 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Current Protocols in Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surgical Neurology. 67 (6), 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathologica. 72 (4), 315-325 (1987).
- Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (76), e50370 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Bath, P. M., Macleod, M. R., Green, A. R. Emulating multicentre clinical stroke trials: a new paradigm for studying novel interventions in experimental models of stroke. International Journal of Stroke: Official Journal of the INternational Stroke Society. 4 (6), 471-479 (2009).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 94-99 (2010).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. Retooling laser speckle contrast analysis algorithm to enhance non-invasive high resolution laser speckle functional imaging of cutaneous microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 1 (1), 53-60 (1981).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e511729 (2014).
- Cramer, J. V., et al. In vivo widefield calcium imaging of the mouse cortex for analysis of network connectivity in health and brain disease. Neuroimage. 199, 570-584 (2019).
- Heindl, S., et al. Automated morphological analysis of microglia after stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642-651 (2018).
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33 (7), 1869-1875 (2002).
- Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies. Archives of Neurology. 59 (12), 1870-1873 (2002).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. Journal of Neuroscience Methods. 170 (1), 35-44 (2008).
