Absorption de petites vésicules extracellulaires étiquetées par fluorescence in vitro et dans la moelle épinière
Summary
Nous décrivons un protocole pour étiqueter les petites vésicules extracellulaires dérivées de macrophages avec des colorants PKH et observons leur absorption in vitro et dans la moelle épinière après l’administration intrathécale.
Abstract
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des vésicules de 50 à 150 nm sécrétées par toutes les cellules et présentes dans les fluides corporels. Les sEV transfèrent des biomolécules telles que l’ARN, les protéines et les lipides du donneur aux cellules acceptrices, ce qui en fait des médiateurs de signalisation clés entre les cellules. Dans le système nerveux central (SNC), les sEV peuvent servir de médiateur à la signalisation intercellulaire, y compris les interactions neuro-immunes. Les fonctions sEV peuvent être étudiées en suivant l’absorption des SEV marqués dans les cellules receveuses in vitro et in vivo. Cet article décrit l’étiquetage des sEV à partir du milieu conditionné des cellules macrophages RAW 264.7 à l’aide d’un colorant membranaire PKH. Il montre l’absorption de différentes concentrations de sEV marqués à plusieurs moments par les cellules Neuro-2a et les astrocytes primaires in vitro. On a également montré l’absorption des SEV délivrés par voie intrathécale dans les neurones de la moelle épinière, les astrocytes et les microglies de souris visualisés par microscopie confocale. Les résultats représentatifs démontrent une variation dépendante du temps dans l’absorption des sEV par différentes cellules, ce qui peut aider à confirmer l’administration réussie des sEV dans la moelle épinière.
Introduction
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des vésicules nanométriques dérivées de membranes d’une taille comprise entre 50 et 150 nm. Ils proviennent de corps multivésiculaires (M MVB) et sont libérés par les cellules lors de la fusion des M MVB avec la membrane plasmique. Les sEV contiennent des miARN, des ARNm, des protéines et des lipides bioactifs, et ces molécules sont transférées entre les cellules sous forme de communication de cellule à cellule. Les sEV peuvent être internalisés par les cellules réceptrices par une variété de voies endocytaires, et cette capture des sEV par les cellules réceptrices est médiée par la reconnaissance de molécules de surface sur les VE et les cellules cibles1.
Les sEV ont gagné en intérêt en raison de leur capacité à déclencher des changements moléculaires et phénotypiques dans les cellules acceptrices, de leur utilité en tant qu’agent thérapeutique et de leur potentiel en tant que transporteurs de molécules de cargaison ou d’agents pharmacologiques. En raison de leur petite taille, l’imagerie et le suivi des VES peuvent être difficiles, en particulier pour les études in vivo et les contextes cliniques. Par conséquent, de nombreuses méthodes ont été développées pour étiqueter et imager les sEV afin d’aider leur biodistribution et leur suivi in vitro et in vivo2.
La technique la plus courante pour étudier la biodistribution sEV et les interactions cellulaires cibles consiste à les étiqueter avec des molécules de colorant fluorescent3,4,5,6,7. Les VÉHICULES électriques ont d’abord été marqués avec des colorants à membrane cellulaire couramment utilisés pour imager les cellules. Ces colorants fluorescents colorent généralement la bicouche lipidique ou les protéines d’intérêt sur les sEV. Plusieurs colorants lipophiles présentent un fort signal fluorescent lorsqu’ils sont incorporés dans le cytosol, notamment diR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-iodure de tétraméthyindotricarbocyanine), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′,3′-tétraméthyl indocarbocyanine perchlorate) et DiD (1, 1′-dioctadécyyl-3, 3, 3′-tétraméthyl indocarbocyanine 4-chlorobenzènesulfonate sel)8,9,10,11.
D’autres colorants lipophiles, tels que PKH67 et PKH26, ont un groupe de tête polaire hautement fluorescent et une longue queue d’hydrocarbure aliphatique qui s’intercale facilement dans n’importe quelle structure lipidique et conduit à une rétention de colorant à long terme et à une fluorescence stable12. Les colorants PKH peuvent également étiqueter les véhicules électriques, ce qui permet d’étudier les propriétés des véhicules électriques in vivo13. De nombreux autres colorants ont été utilisés pour observer les exosomes en utilisant la microscopie à fluorescence et la cytométrie en flux, y compris les colorants de marquage des lipides14 et les colorants perméables aux cellules tels que l’ester de diacétate de carboxyfluorescéine succinimidyle (CFDA-SE)15,16 et l’ester d’acétoxyméthyl (AM) de calcéine17.
Des études sur la diaphonie médiée par le SEV entre différentes cellules du SNC ont fourni des informations importantes sur la pathogenèse des maladies neuroinflammatoires et neurodégénératives18. Par exemple, les sEV des neurones peuvent propager des peptides bêta-amyloïdes et des protéines tau phosphorylées et aider à la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer19. De plus, les VE dérivés des érythrocytes contiennent de grandes quantités d’alpha-synucléine et peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et contribuer à la pathologie de Parkinson20. La capacité des sEV à franchir les barrières physiologiques21 et à transférer leurs biomolécules aux cellules cibles en fait des outils pratiques pour délivrer des médicaments thérapeutiques auSNC 22.
La visualisation de l’absorption de sEV par une myriade de cellules du SNC dans la moelle épinière permettra à la fois des études mécanistes et l’évaluation des avantages thérapeutiques des sEV administrés de manière exogène à partir de diverses sources cellulaires. Cet article décrit la méthodologie pour étiqueter les sEV dérivés de macrophages et imager leur absorption in vitro et in vivo dans la moelle épinière lombaire par les neurones, les microglies et les astrocytes afin de confirmer qualitativement l’administration de sEV par visualisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons montré l’étiquetage des sEV avec des colorants PKH et la visualisation de leur absorption dans la moelle épinière. Les colorants fluorescents lipophiles PKH sont largement utilisés pour le marquage des cellules par cytométrie en flux et microscopie fluorescente3,5,6,12,24,25. En raison de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions du NIH NINDS R01NS102836 et du Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) accordées à Seena K. Ajit. Nous remercions le Dr Bradley Nash pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
Referências
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
