फ्लोरोसेंट का तेज छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स इन विट्रो और स्पाइनल कॉर्ड में लेबल किया गया
Summary
हम पीकेएच रंगों के साथ मैक्रोफेज-व्युत्पन्न छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स को लेबल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और इंट्राथेकल डिलीवरी के बाद विट्रो और रीढ़ की हड्डी में उनके तेज का निरीक्षण करते हैं।
Abstract
छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (एसईवी) 50-150 एनएम वेसिकल्स हैं जो सभी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और शारीरिक तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। SEVs ऐसे आरएनए, प्रोटीन, और लिपिड जैसे जैव अणुओं को दाता से स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में स्थानांतरित करते हैं, जिससे वे कोशिकाओं के बीच प्रमुख संकेत मध्यस्थ बन जाते हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, एसईवी न्यूरोइम्यून इंटरैक्शन सहित इंटरसेलुलर सिग्नलिंग में मध्यस्थता कर सकते हैं। सेव कार्यों को इन विट्रो और वीवो दोनों में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में लेबल वाले एसईवी के तेज को ट्रैक करके अध्ययन किया जा सकताहै । यह पेपर पीकेएच झिल्ली डाई का उपयोग करके रॉ 264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से एसईवी की लेबलिंग का वर्णन करता है। यह न्यूरो-2ए कोशिकाओं और प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स इन विट्रोद्वारा कई समय बिंदुओं पर लेबल किए गए एसईवी की विभिन्न सांद्रता के तेज को दर्शाता है। यह भी दिखाया गया है कि माउस स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना किए गए माइक्रोग्लिया में इंट्राथेकेली रूप से वितरित SEVs का तेज है। प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न कोशिकाओं द्वारा एसईवी के तेज में समय पर निर्भर भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, जो रीढ़ की हड्डी में सफल एसईवी वितरण की पुष्टि करने में मदद कर सकता है।
Introduction
छोटे एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (एसईवी) नैनोसाइज्ड, झिल्ली-व्युत्पन्न वेसिकल्स हैं, जिनका आकार 50-150 एनएम है। वे बहु-वेसिकुलर निकायों (एमवीबी) से उत्पन्न होते हैं और प्लाज्मा झिल्ली के साथ एमवीबी के संलयन पर कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं। SEVs में मीन्राना, एमएचआरए, प्रोटीन और बायोएक्टिव लिपिड होते हैं, और इन अणुओं को कोशिका-से-कोशिका संचार के रूप में कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित किया जाता है। एसईवी को विभिन्न प्रकार के एंडोसाइटिक रास्तों द्वारा प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया जा सकता है, और प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा एसईवी का यह कैप्चर ईवीएस और लक्ष्य कोशिकाओं दोनों पर सतह के अणुओं की मान्यता द्वारा मध्यस्थता की जाती है1।
SEVs अपनी क्षमता के कारण ब्याज प्राप्त किया है स्वीकारकर्ता कोशिकाओं में आणविक और phenotypic परिवर्तन ट्रिगर, एक चिकित्सकीय एजेंट के रूप में उनकी उपयोगिता, और कार्गो अणुओं या औषधीय एजेंटों के लिए वाहक के रूप में उनकी क्षमता । उनके छोटे आकार के कारण, एसईवी की इमेजिंग और ट्रैकिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है, खासकर वीवो अध्ययन और नैदानिक सेटिंग्स में। इसलिए, विट्रो और वीवो2में उनके बायोडिविशनल और ट्रैकिंग की सहायता करने के लिए एसईवी को लेबल और छवि बनाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं।
एसईवी बायोडिव्रिब्यूशन और टारगेट सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की सबसे आम तकनीक में उन्हें फ्लोरोसेंट डाई अणुओं 3 ,4,5 ,6,7के साथ लेबल करना शामिल है । ईवीएस को शुरू में कोशिका झिल्ली रंगों के साथ लेबल किया गया था जो आमतौर पर छवि कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाते थे। ये फ्लोरोसेंट रंग आम तौर पर एसईवी पर लिपिड बाइलेयर या ब्याज के प्रोटीन को दाग देते हैं। साइटोसोल में शामिल होने पर कई लिपोफिलिक रंग एक मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रदर्शित करते हैं, जिसमें डीआईआर (1,1′-डायक्टाडेसिल-3,3,3′,3′-टेट्रामेथाइलिंटोट्रिकरबोसायनी आयोडाइड), डीआईएल (1, 1′-डायक्टाडाइल-3, 3, 3′, 3′-टेट्रामेथिल इंडोकार्बोसिनाइन परक्लोरेट), और डीआईडी (1, 1′-डायक्टाडेसिल-3, 3, 3′, 3′-टेट्रामेथिल इंडोकार्बोसायनिन 4-क्लोरोबेनजेनेसुलफनेट नमक)8,9,10,11।
PKH67 और PKH26 जैसे अन्य लिपोफिलिक रंगों में एक अत्यधिक फ्लोरोसेंट ध्रुवीय प्रमुख समूह और एक लंबी एलिफेटिक हाइड्रोकार्बन पूंछ होती है जो आसानी से किसी भी लिपिड संरचना में इंटरकैलेट करती है और दीर्घकालिक डाई प्रतिधारण और स्थिर फ्लोरेसेंस12की ओर ले जाती है। PKH रंग ईवीएस को भी लेबल कर सकते हैं, जो वीवो13में ईवी गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एक्सोसोम्स का निरीक्षण करने के लिए कई अन्य रंगों का उपयोग किया गया है, जिसमें लिपिड-लेबलिंग रंग14 और सेल-पारगम्य रंग जैसे कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट सुसिनिमिडिल एस्टर (सीएफडीए-एसई)15,16 और कैल्सीन एसिटॉक्सीमिथिल (एएम) एस्टर17शामिल हैं।
सीएनएस में विभिन्न कोशिकाओं के बीच एसईवी-मध्यस्थता क्रॉसटॉक के अध्ययनों ने न्यूरोइंफ्लेमेटरी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों18के रोगजनन पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स से SEVs बीटा-एमिलॉयड पेप्टाइड्स और फॉस्फोरिलेटेड ताऊ प्रोटीन और अल्जाइमर रोग19के रोगजनन में सहायता फैल सकता है । इसके अतिरिक्त, एरिथ्रोसाइट्स से प्राप्त ईवीएस में बड़ी मात्रा में अल्फा-सिन्यूक्लिन होते हैं और रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार कर सकते हैं और पार्किंसंस की विकृति20में योगदान दे सकते हैं। SEVs की शारीरिक बाधाओं को पार करने की क्षमता21 और उनके जैव अणुओं को लक्षित कोशिकाओं में स्थानांतरित करने से उन्हें सीएनएस22में चिकित्सीय दवाओं को वितरित करने के लिए सुविधाजनक उपकरण बन जाते हैं ।
रीढ़ की हड्डी में असंख्य सीएनएस कोशिकाओं द्वारा सेव तेज की कल्पना करने से मशीनी अध्ययन और विभिन्न सेलुलर स्रोतों से एक्सोजेनोसली प्रशासित एसईवी के चिकित्सीय लाभों का मूल्यांकन दोनों सक्षम होंगे। यह पेपर मैक्रोफेज से प्राप्त SEVs को लेबल करने की पद्धति का वर्णन करता है और काठ की रीढ़ की हड्डी में और वीवो में न्यूरॉन्स, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स द्वारा दृश्य द्वारा एसईवी वितरण की गुणात्मक पुष्टि करने के लिए उनकी गति को छवि देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हमने पीकेएच रंगों के साथ SEVs की लेबलिंग और रीढ़ की हड्डी में उनके तेज के दृश्य को दिखाया। पीकेएच लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट रंगों का व्यापक रूप से उपयोग कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री और फ्लो?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एनआईएच एनआईएनडीएस R01NS102836 और पेंसिल्वेनिया डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ कॉमनवेल्थ यूनिवर्सल रिसर्च एन्हांसमेंट (इलाज) से मिलेना के अजीत को दिए गए अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ ब्राडली नैश का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
Referências
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