우리는 PKH 염료로 대식세포 유래 작은 세포외 소포를 라벨과 시험관 내 및 척수에서 그들의 upup을 관찰하는 프로토콜을 기술합니다.
작은 세포 외 소포 (sEV)는 모든 세포에 의해 분비되고 체액에 존재하는 50-150 nm 소포입니다. sEV는 RNA, 단백질 및 지질과 같은 생체 분자를 기증자에서 수용세포로 이송하여 세포 간의 주요 신호 중재자를 만듭니다. 중추 신경계 (CNS)에서 sEV는 신경 면역 상호 작용을 포함하여 세포 간 신호를 중재 할 수 있습니다. sEV 기능은 생체외 및 생체 내 모두 받는 사람 세포에서 표지된 sEV의 섭취량을 추적하여 연구할 수 있다. 이 논문은 PKH 멤브레인 염료를 사용하여 RAW 264.7 대식세포의 조건부 매체로부터 sEV의 라벨링을 설명합니다. 그것은 신경-2a 세포와 시험관내1 차 성상세포에 의해 여러 시간 지점에서 표지된 sEV의 다른 농도의 uptakes를 보여줍니다. 또한 마우스 척수 뉴런, 성상세포 및 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화된 미세glia에서 내trathecally를 전달한 sEV의 섭취도 표시됩니다. 대표적인 결과는 척수로 성공적인 sEV 납품을 확인하는 것을 도울 수 있는 다른 세포에 의하여 sEV의 uptake에 있는 시간 의존적인 변이를 보여줍니다.
작은 세포 외 소포 (sEV)는 나노 크기, 50-150 nm의 크기 범위와 멤브레인 소포입니다. 그(것)들은 다중 vesicular 바디 (MVBs)에서 유래하고 플라즈마 막과 MVB의 융합에 세포에서 풀어 놓입니다. sEV는 miRNAs, mRNA, 단백질 및 생리활성 지질을 포함하고, 이 분자는 세포 간 세포 통신의 형태로 세포 사이 옮겨질 것입니다. sEV는 다양한 내막 경로에 의해 수신자 세포에 의해 내부화될 수 있으며, 수신자 세포에 의한 sEV의 이러한 포획은 EV와 표적 세포1모두에 대한 표면 분자의 인식에 의해 중재된다.
sEV는 수용체 세포의 분자 및 현상 변화를 유발할 수 있는 능력, 치료제로서의 유용성, 화물 분자 또는 약리학제의 운반선으로서의 잠재력으로 인해 관심을 얻고 있습니다. 그들의 작은 크기 때문에, sEV의 화상 진찰 및 추적은 특히 생체 내 연구 및 임상 설정에 도전적일 수 있습니다. 따라서 생체 내 및 생체 내 및 생체 내 추적을 지원하기 위해 라벨 및 이미지 sEV를 표시하고 이미지 sEV를개발하는 많은 방법이 개발되었다.
sEV 생체 분포및 표적 세포 상호 작용을 연구하는 가장 일반적인 기술은 형광염염료 분자3,4,5,6,7로라벨을 붙이는 것을 포함한다. 전기 는 처음에 일반적으로 이미지 세포에 사용 된 세포막 염료로 표시 되었다. 이 형광 염료는 일반적으로 sEV에 관심있는 지질 이중 층 또는 단백질을 얼룩. 몇몇 지방성 염료는 디르 (1,1′-디옥타데딜-3,3,3′,3′-테트라메틸린도트리카르보시아노니 오오드), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시아닌 과염소산염), 및 DiD (1, 1′-디옥타데킬-3, 3, 3′, 3′, 3′-테트라메틸 인도카르보시야닌 4-클로로벤젠술포네이트 소금)8,9,101.
PKH67 및 PKH26과 같은 다른 지방성 염료는, 고형성 극지 헤드 그룹과 어떤 지질 구조로 쉽게 상호 작용하고 장기 염료 보존 및 안정적인 형광12로이어지는 긴 알리파성 탄화수소 꼬리를 갖는다. PKH 염료는 또한 EV 라벨을 지정할 수 있으며, 이는 생체 내에서EV 속성의 연구를 할 수 있습니다13. 다른 많은 염료는 형광 현미경 검사법과 유동 세포종을 사용하여 외종을 관찰하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 지질 라벨염료14 및 카박스시플루오레세인 디아세테이트 succinimidyl ester(CFDA-SE)15,16 및 칼세옥 아세틸(AM)
CNS에 있는 다른 세포 사이 sEV 매개 한 교차토크의 연구 결과는 신경 염증성 및 신경 퇴행성 질환의 병인에 중요한 통찰력을 제공했다18. 예를 들어, 뉴런으로부터의 sEV는 베타 아밀로이드 펩타이드와 인광타우 단백질을 퍼뜨리고알츠하이머병(19)의발병에 도움을 주어 질 수 있다. 추가적으로, 적혈구에서 파생된 전기는 많은 양의 알파-시뉴클레인을 함유하고 있으며 혈액-뇌 장벽을 넘어파킨슨병증(20)에기여할 수 있다. sEV의 능력은 생리적 장벽을교차하고 표적 세포에 자신의 생체 분자를 전송하는 그들에게 CNS22에치료 약물을 전달하는 편리한 도구를 만든다.
척수에 있는 무수한 CNS 세포에 의하여 sEV upup를 시각화하는 것은 기계학 연구 및 각종 세포 근원에서 외인성 관리한 sEV의 치료 이득의 평가를 둘 다 가능하게 할 것입니다. 이 논문은 대식세포에서 파생된 sEV를 라벨로 지정하고 생체외에서 의 기생을 이미지하고 뉴런, 마이크로글리아 및 성상세포에 의해 요추 척수에서 생체내로 분류하여 시각화에 의한 sEV 전달을 질적으로 확인하는 방법을 설명합니다.
이 프로토콜에서, 우리는 PKH 염료와 sEV의 라벨링과 척수에 그들의 섭취량의 시각화를 보여주었습니다. PKH 리포필릭 형광염은 세포측정 및형광 현미경검사3,5,6,12,24,25를유동하여 세포 라벨링에 널리 사용된다. 상대적으로 긴 반감기 와 낮은 세포 독…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIH NINDS R01NS102836및 펜실베니아 보건부 유니버설 연구 강화(CURE)의 보조금에 의해 지원되었으며, 시나 K. 아지트에게 수여되었습니다. 우리는 원고의 비판적 독서에 대한 박사 브래들리 내쉬 에게 감사드립니다.
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
Tween 20 | |||
Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |