Opptak av fluorescerende merket små ekstracellulære vesicles in vitro og i ryggmargen
Summary
Vi beskriver en protokoll for å merke makrofag-avledede små ekstracellulære vesikler med PKH-fargestoffer og observere deres opptak in vitro og i ryggmargen etter intratekal levering.
Abstract
Små ekstracellulære vesicles (sEVs) er 50-150 nm vesicles utskilt av alle celler og tilstede i kroppsvæsker. sEVer overfører biomolekyler som RNA, proteiner og lipider fra donor til akseptorceller, noe som gjør dem til viktige signalmeglere mellom celler. I sentralnervesystemet (CNS) kan sEVer megle intercellulær signalering, inkludert nevroimmune interaksjoner. sEV-funksjoner kan studeres ved å spore opptaket av merkede sEVer i mottakerceller både in vitro og in vivo. Dette dokumentet beskriver merking av sEVer fra det betingede mediet til RAW 264.7 makrofagceller ved hjelp av en PKH-membranfarge. Det viser opptaket av forskjellige konsentrasjoner av merkede sEVer på flere tidspunkter av Neuro-2a celler og primære astrocytter in vitro. Også vist er opptaket av sEVs levert intrathecally i musen ryggmargen nevroner, astrocytter, og mikroglia visualisert av konfekt mikroskopi. De representative resultatene viser tidsavhengig variasjon i opptaket av sEVer av forskjellige celler, noe som kan bidra til å bekrefte vellykket sEVs-levering i ryggmargen.
Introduction
Små ekstracellulære vesicles (sEVs) er nanosized, membran-avledede vesicles med et størrelsesområde på 50-150 nm. De stammer fra multi-vesikulære organer (MVB) og frigjøres fra celler ved sammensmelting av MVB-ene med plasmamembranen. sEVer inneholder miRNAer, mRNAer, proteiner og bioaktive lipider, og disse molekylene overføres mellom celler i form av celle-til-celle-kommunikasjon. sEVer kan internaliseres av mottakerceller ved hjelp av en rekke endokytiske veier, og denne fangsten av sEVer av mottakerceller formidles av anerkjennelsen av overflatemolekyler på både elbiler og målcellene1.
sEVs har fått interesse på grunn av deres evne til å utløse molekylære og fenotypiske endringer i akseptorceller, deres nytte som terapeutisk middel, og deres potensial som bærere for lastmolekyler eller farmakologiske midler. På grunn av sin lille størrelse kan avbildning og sporing av sEVer være utfordrende, spesielt for in vivo-studier og kliniske omgivelser. Derfor er mange metoder utviklet for å merke og bilde sEVs for å hjelpe deres biodistribusjon og sporing in vitro og in vivo2.
Den vanligste teknikken for å studere sEV biodistribusjon og målcelleinteraksjoner innebærer å merke dem med fluorescerende fargemolekyler3,4,5,6,7. Elbiler ble opprinnelig merket med cellemembranfarger som ofte ble brukt til å bildeceller. Disse fluorescerende fargestoffene flekker vanligvis lipidbilayeren eller proteiner av interesse på sEVer. Flere lipofile fargestoffer viser et sterkt fluorescyl når det innlemmes i cytosolen, inkludert DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine jod), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indocarbocyanine perklorat), og DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyanine 4-klorobenzenesulfonat salt)8,9,10,11.
Andre lipofile fargestoffer, som PKH67 og PKH26, har en svært fluorescerende polarhodegruppe og en lang alifatisk hydrokarbonhale som lett interkalerer inn i enhver lipidstruktur og fører til langsiktig fargestoffretensjon og stabil fluorescens12. PKH fargestoffer kan også merke elbiler, noe som gjør det mulig å studere EV-egenskaper i vivo13. Mange andre fargestoffer har blitt brukt til å observere eksosomer ved hjelp av fluorescensmikroskopi og strømningscytometri, inkludert lipidmerkingsfargestoffer14 og cellegjennomtrengelige fargestoffer som karboksyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA-SE)15,16 og calcein acetoxymetyl (AM) ester17.
Studier av sEV-mediert krysstale mellom forskjellige celler i CNS har gitt viktig innsikt i patogenesen av nevroinflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer18. For eksempel kan sEVer fra nevroner spre beta-amyloidpeptider og fosforylerte tauproteiner og hjelpe til med patogenesen av Alzheimers sykdom19. I tillegg inneholder elbiler avledet fra erytrocytter store mengder alfasynuklein og kan krysse blod-hjernebarrieren og bidra til Parkinsons patologi20. SEVs evne til å krysse fysiologiske barrierer21 og overføre biomolekylene til målceller gjør dem praktiske verktøy for å levere terapeutiske legemidler til CNS22.
Visualisering av sEV-opptak av utallige CNS-celler i ryggmargen vil muliggjøre både mekanistiske studier og evaluering av de terapeutiske fordelene ved eksogent administrerte sEVer fra ulike cellulære kilder. Dette dokumentet beskriver metodikken for å merke sEVer avledet fra makrofager og bilde deres opptak in vitro og in vivo i lumbale ryggmargen av nevroner, mikroglia og astrocytter for å kvalitativt bekrefte sEV levering ved visualisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen viste vi merking av sEVer med PKH-fargestoffer og visualisering av opptaket i ryggmargen. PKH lipofile fluorescerende fargestoffer er mye brukt til merking av celler ved strømning cytometri og fluorescerende mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grunn av deres relativt lange halveringstid og lav cytotoksisitet, k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra NIH NINDS R01NS102836 og Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) tildelt Seena K. Ajit. Vi takker Dr. Bradley Nash for kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
Referências
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
