Поглощение флуоресцентных меченых малых внеклеточных везикул in vitro и в спинном мозге
Summary
Мы описываем протокол маркировки небольших внеклеточных везикул, полученных из макрофагов, красителями PKH и наблюдаем их поглощение in vitro и в спинном мозге после интратекальной доставки.
Abstract
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой везикулы 50-150 нм, секретируемые всеми клетками и присутствующие в жидкостях организма. sEV переносят биомолекулы, такие как РНК, белки и липиды, от донорских к акцепторным клеткам, что делает их ключевыми сигнальными медиаторами между клетками. В центральной нервной системе (ЦНС) sEV могут опосредовать межклеточную сигнализацию, включая нейроиммунные взаимодействия. Функции sEV могут быть изучены путем отслеживания поглощения меченых sEV в клетках-реципиентах как in vitro, так и in vivo. В данной работе описывается маркировка sEV из кондиционированных сред клеток макрофагов RAW 264.7 с использованием мембранного красителя PKH. Он показывает поглощение различных концентраций меченых sEV в несколько временных точек клетками Neuro-2a и первичными астроцитами in vitro. Также показано поглощение sEV, доставляемых интратекально в нейроны спинного мозга мыши, астроциты и микроглию, визуализированные конфокальной микроскопией. Репрезентативные результаты демонстрируют зависящие от времени вариации в поглощении sEV различными клетками, что может помочь подтвердить успешную доставку sEV в спинной мозг.
Introduction
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) представляют собой наноразмерные, мембранные везикулы с диапазоном размеров 50-150 нм. Они происходят из многовезикулярных тел (MVB) и высвобождаются из клеток при слиянии MVB с плазматической мембраной. sEV содержат миРНК, мРНК, белки и биологически активные липиды, и эти молекулы переносятся между клетками в форме межклеточной связи. sEV могут быть интернализованы клетками-реципиентами различными эндоцитарными путями, и этот захват sEV клетками-реципиентами опосредован распознаванием поверхностных молекул как на EV, так и на клетках-мишенях1.
sEV приобрели интерес из-за их способности вызывать молекулярные и фенотипические изменения в акцепторных клетках, их полезности в качестве терапевтического агента и их потенциала в качестве носителей для грузовых молекул или фармакологических агентов. Из-за их небольшого размера визуализация и отслеживание sEV могут быть сложными, особенно для исследований in vivo и клинических условий. Поэтому было разработано много методов для маркировки и изображения sEV, чтобы помочь их биораспределению и отслеживанию in vitro и in vivo2.
Наиболее распространенный метод изучения биораспределения sEV и взаимодействия клеток-мишеней включает их маркировку флуоресцентными молекулами красителя3,4,5,6,7. Электромобили были первоначально помечены красителями клеточной мембраны, которые обычно использовались для изображения клеток. Эти флуоресцентные красители обычно окрашивают липидный бислой или белки, представляющие интерес на sEV. Несколько липофильных красителей демонстрируют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль, включая DiR (1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндотрикарбоцианин йодид), DiL (1, 1′-диоктадецил-3, 3,3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат) и DiD (1, 1′-диоктадецил-3, 3′, 3′-тетраметилиндокарбоцианин 4-хлорбензолсульфонатная соль)8,9,10,11.
Другие липофильные красители, такие как PKH67 и PKH26, имеют высокофлуоресцентную полярную головную группу и длинный алифатический углеводородный хвост, который легко интеркалируется в любую липидную структуру и приводит к долгосрочному удержанию красителя и стабильной флуоресценции12. Красители PKH также могут маркировать EV, что позволяет изучать свойства EV in vivo13. Многие другие красители были использованы для наблюдения экзосом с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии, включая липидные красители14 и клеточно-проницаемые красители, такие как карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир (CFDA-SE)15,16 и кальцеин ацетоксиметил (AM) эфир17.
Исследования sEV-опосредованных перекрестных помех между различными клетками в ЦНС дали важную информацию о патогенезе нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний18. Например, sEV из нейронов могут распространять бета-амилоидные пептиды и фосфорилированные тау-белки и помогать в патогенезе болезни Альцгеймера19. Кроме того, EV, полученные из эритроцитов, содержат большое количество альфа-синуклеина и могут пересекать гематоэнцефалический барьер и способствовать патологии Паркинсона20. Способность sEV пересекать физиологические барьеры21 и переносить свои биомолекулы в клетки-мишени делает их удобными инструментами для доставки терапевтических препаратов в ЦНС22.
Визуализация поглощения сЭВ мириадами клеток ЦНС в спинном мозге позволит как механистические исследования, так и оценить терапевтические преимущества экзогенно вводимых sEV из различных клеточных источников. В данной работе описана методология маркировки sEV, полученных из макрофагов, и изображения их поглощения in vitro и in vivo в поясничном спинном мозге нейронами, микроглией и астроцитами для качественного подтверждения доставки sEV путем визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы показали маркировку sEV красителями PKH и визуализацию их поглощения в спинном мозге. Липофильные флуоресцентные красители PKH широко используются для маркировки клеток с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии3,5,</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами NIH NINDS R01NS102836 и Департаментом здравоохранения Пенсильвании Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE), присужденными Сиене К. Аджит. Мы благодарим доктора Брэдли Нэша за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | cell dissociation enzyme | ||
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | |||
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
Referências
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R. Fluorescent labeling of extracellular vesicles. Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -. Y., Chien, J. C. -. Y., Lai, C. P. -. K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-‘tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -. t., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -. C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
