Модель экспериментального стеатоза in vitro:культура клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой
Summary
Этот протокол предназначен для изучения стеатоза и молекулярных, биохимических, клеточных изменений, вызванных чрезмерным воздействием липидов in vitro нагепатоциты.
Abstract
Метаболическая дисфункция,связанная с жировой болезнью печени (МАЖБП), ранее известная как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), является наиболее распространенным заболеванием печени во всем мире из-за его связи с ожирением, диабетом 2 типа и дислипидемией. Стеатоз печени, накопление липидных капель в паренхиме печени, является ключевым признаком заболевания, предшествующего воспалению, наблюдаемому при стеатогепатите, фиброзе и конечной стадии заболевания печени. Накопление липидов в гепатоцитах может мешать правильному метаболизму ксенобиотиков и эндогенных молекул, а также индуцировать клеточные процессы, ведущие к прогрессированию заболевания. Хотя экспериментальное исследование стеатоза может быть выполнено in vivo,подходы in vitro к изучению стеатоза являются дополнительными инструментами с различными преимуществами. Культура гепатоцитов в среде, обусловленной перегрузкой липидов, является отличным воспроизводимым вариантом для изучения стеатоза печеночной области, позволяя идентифицировать клеточные процессы, связанные с накоплением липидов, такие как окислительные и ретикулярные стрессы, аутофагия, пролиферация, гибель клеток и т. Д., А также другие испытания, включая эффективность лекарств, и токсикологическое тестирование, среди многих других возможных применений. Здесь было направлено на описание методики культивирование клеток гепатоцитов в липидной среде, обусловленной перегрузкой. Клетки HepG2 культивировали в среде RMPI 1640, кондиционированной пальмитатом натрия и олеатом натрия. Важно отметить, что соотношение этих двух липидов имеет решающее значение для благоприятство накоплению липидных капель, сохраняя при этом пролиферацию клеток и умеренную смертность, как это происходит в печени во время заболевания. Показана методика приготовления запасов липидного раствора, смеси, добавления в среду и культуры гепатоцитов. С помощью этого подхода можно идентифицировать липидные капли в гепатоцитах, которые легко наблюдаются при окрашивание Oil-red O, а также кривые показателей пролиферации / смертности.
Introduction
Жировая дистрофия печени, связанная с метаболической дисфункцией, широко распространена во всем мире1,2; по оценкам, до 25% населения страдает3. Это заболевание, ранее известное как неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), обновило свою номенклатуру к метаболической дисфункции, связанной с жировой болезнью печени (МАЖБП), чтобы точно отразить патогенез, связанный с ожирением, резистентностью к инсулину, диабетом 2 типа и дислипидемией, а также возможные методы лечения заболевания3,4.
Независимо от названия, заболевание включает в себя широкий спектр гистопатологических изменений, характеризующихся аномально высоким накоплением липидов в печени (>5% жира в гепатоцитах5)и может прогрессировать через накопление липидов, обычно встречающееся при простом стеатозе, до стеатогепатита, что, в свою очередь, может привести к развитию фиброза, цирроза, гепатоцеллюлярная карцинома и печеночная недостаточность5,6,7,8. Ожидается, что из-за его растущей распространенности МАЖБП станет первым признаком трансплантации печени и основной причиной гепатоцеллюлярной карциномы9.
Хотя он считается доброкачественной или легкой формой жировой болезни печени, стеатоз печени на самом деле является метаболическим ключом в MAFLD10. Различные метаболические пути зависят от накопления липидов в печени, включая, но не ограничиваясь, синтезом, экспортом и метаболизмом липидов10. Инсулинорезистентность, окислительный стресс, ретикулярный стресс и клеточная дисфункция тесно связаны с печеночной липотоксичностью11,12. С другой стороны, жировые гепатоциты являются мишенью активных форм кислорода, претворяя метаболиты в виде перекисей липидов, белковых карбонилов и аддуктов нуклеиновых кислот13. На клеточном уровне жировые гепатоциты могут подвергаться митохондриальному повреждению14,клеточному старению15,апоптозу16,пироптозу12и аутофагии17,среди других событий.
Гепатоциты высоко отвечают за метаболизм, детоксикацию и синтез широкого спектра молекул. Многие из этих функций могут быть скомпрометированы накоплением липидов, наблюдаемым при стеатозе. Поэтому очень важно иметь воспроизводимые инструменты, позволяющие точно оценить стеатоз. В этом смысле модели in vitro легко применимы и воспроизводимы. Стеатоз in vitro использовался с различными целями16,18,19. Клетки HepG2 широко используются в качестве клеточной линии гепатоцитов. Он имеет такие преимущества, как легкость в культуре и хорошая характеристика. Пожалуй, единственным недостатком клеток HepG2 является тот факт, что это канцерогенная клеточная линия, поэтому это необходимо учитывать при анализе исходов. Здесь показано применение смеси жирных кислот, широко используемых в клеточной культуре: пальмитиновой кислоты (ПА) и олеиновой кислоты (ОА). И PA, и OA предлагают разные результаты в культуре20. ПА (С 16:0) является наиболее распространенной насыщенной жирной кислотой, получаемой из рациона16. ПА рассматривается как биомаркер де-ново липогенеза,важнейшего шага в развитии НАЖБП21. Показано, что ПА высокотоксична22; поэтому может быть не рекомендуется индуцировать стеатоз in vitro. ОА (C 18:1) является мононенасыщенной жирной кислотой. В отличие от ПА, было высказано предположение, что ОА обладает противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, будучи способным противодействовать ПА12. Как ПА, так и ОА являются основными жирными кислотами, присутствующими в триглицеридах, независимо от состояния здоровья или заболевания16. В таблице 1 приведены примеры культуры гепатоцитов с ПА, ОА и их смесью, а также результаты, о которыхсообщается12,23,24,25,26,27. Другие жирные кислоты также использовались в культуре гепатоцитов, включая стеариновую кислоту (C 18:0)28,29,30,линолевую кислоту (C18:1) 28,30,31 и ее конъюгаты (CLA)28,32,пальмитолеиновую кислоту (C 16:1)29. Тем не менее, их использование реже всего сообщается в литературе, возможно, потому, что их печеночное изобилие ниже, чем PA и OA16.
В сочетании обе жирные кислоты напоминают стеатоз in vitro,обеспечивая пролиферируя клетки, с повышенной гибелью клеток и более низкой жизнеспособностью по сравнению с контрольными условиями. Стоит отметить, что соответствующие соли этих жирных кислот доступны и могут быть использованы. Одна из основных проблем при оценке липидной перегрузки в культуре клеток гепатоцитов приведена в дифференциации токсикологических моделей и модели, наилучшим образом представляющей стеатоз. Многие модели можно отнести в первом случае. Фактически, использование только ПА можно рассматривать среди них, и высокая смертность является наиболее очевидным исходом12,16,23,24,25,26,27. Применение высоких доз даже в случае ОА также можно рассматривать как токсикологическую модель. Показанный здесь протокол находится в более высоком соответствии с развитием стеатоза, поскольку он показывает низкую смертность по сравнению с той, которая наблюдается в других моделях, и позволяет соблюдать его в течение нескольких дней с прогрессирующим накоплением липидов, как это происходит при НАЖБП. Возможность оценить легкий и тяжелый стеатоз через экспериментальные условия считается еще одним преимуществом.
| Жирные кислоты | Условия | Результаты | Ссылка | ||
| ПАПА | Концентрация: 200 мкМ | Накопление липидов | Ян и др., 201925. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Повреждение гепатоцитов | ||||
| Возвышение трансаминаз | |||||
| ПАПА | Концентрация: 50, 100 и 200 мкМ | Накопление липидов | Xing et al, 201924. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| ПАПА | Концентрация: 250 мкМ, 500 мкМ, 750 мкМ и 1 000 мкМ | Накопление липидов | Wang et al, 202026. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Прогрессивное снижение жизнеспособности клеток | ||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация: 1 мМ | Накопление липидов | Xiao et al, 202027. | ||
| Время экспозиции: 24 ч | Не сообщает о липотоксичности | ||||
| Скорость: 2OA: 1PA | |||||
| Смесь ОА/ПА | Первая стимуляция 200 мкМ и 400 мкМ ПА, а затем вторая стимуляция 200 мкМ ОА | Накопление липидов. | Цзэн и др., 202012. | ||
| Концентрация:400 мкМ ПА: 200 мкМ ОА | Доказательства липотоксичности, индуцированной ПА, были уменьшены стимуляцией ОА. | ||||
| Скорость: 2PA: 1OA | |||||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация: 400 мкМ ПА: 200 мкМ ОА | Накопление липидов | Chen et al, 201823. | ||
| Скорость: 2PA: 1OA | |||||
| Время экспозиции: 24 ч | |||||
| Смесь ОА/ПА | Концентрация:50 и 500 мкМ | Генерация двух типов стеатоза: легкого стеатоза и тяжелый стеатоз. |
Кампос и Гусман 2021 | ||
| Скорость: 2PA: 1OA | Моделирует хроническую экспозицию липидной перегрузки | ||||
| Время экспозиции: 24 ч, 2 дня, 3 дня и 4 дня. | |||||
Таблица 1. Культура гепатоцитов в стеатогенных условиях. В таблице представлен тип используемой жирной кислоты, поддерживаемые условия и наблюдаемые результаты в культуре гепатоцитов. О.А.: Пальмитиновая кислота. ОА: Олеиновая кислота.
Наконец, эта модель применима не только к изучению стеатоза и жировой дистрофии печени, но и к печеночному метаболическому, синтетическому и детоксикационному пути в контексте стеатоза. Кроме того, индуцированный стеатоз in vitro может предоставить доказательства для идентификации потенциальных маркеров заболевания, а также терапевтических целей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предназначен для обеспечения стратегии изучения стеатоза in vitro. Клеточная культура является мощным инструментом для изучения клеточных, молекулярных, биохимических и токсикологических аспектов клеток, подвергающихся воздействию различных условий. При таком подхо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальной национальной консилией науки и технологии (Conacyt, CB-221137). Адриана Кампос является докторантом в Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, и была поддержана Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | – |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | – |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | – |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | – |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | – |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | – |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | – |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | – |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | – |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | – |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | – |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
Referências
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease – a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G. Nafld: A multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, 47-64 (2015).
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
