En modell av experimentell steatos in vitro:Hepatocyt cellkultur i lipid överbelastning-konditionerat medium

Summary

Detta protokoll är avsett att vara ett verktyg för att studera steatos och de molekylära, biokemiska, cellulära förändringar som produceras av överexponering av hepatocyter för lipider in vitro.

Abstract

Metabolisk dysfunktion-associerade fettleversjukdom (MAFLD), tidigare känd som alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), är den vanligaste leversjukdomen i världen på grund av dess förhållande till fetma, diabetes typ 2 och dyslipidemi. Leversteatos, ackumulering av lipiddroppar i leverparenkym, är ett viktigt inslag i sjukdomen före inflammationen som observerats vid steatohepatit, fibros och leversjukdom i slutstadiet. Lipid ackumulering i hepatocyter kan störa korrekt metabolism av xenobiotika och endogena molekyler, samt att inducera cellulära processer som leder till sjukdomsförloppet. Även om den experimentella studien av steatos kan utföras in vivo, är in vitro-metoder för studier av steatos kompletterande verktyg med olika fördelar. Hepatocyt kultur i lipid överbelastning-konditionerade medium är ett utmärkt reproducerbart alternativ för studier av lever steatosis tillåter identifiering av cellulära processer relaterade till lipid ackumulering, såsom oxidativa och reticular påfrestningar, autofagi, spridning, celldöd, etcetera, liksom andra tester inklusive läkemedelseffektivitet, och toxikologiska tester, bland många andra möjliga tillämpningar. Här syftade det till att beskriva metoden för hepatocyt cell kultur i lipid överbelastning-konditionerade medium. HepG2 celler odlades i RMPI 1640 medium konditionerade med natriumpalmitat och natriumoleat. Viktigt är förhållandet mellan dessa två lipider avgörande för att gynna lipiddroppe ackumulering, samtidigt upprätthålla cellproliferation och en måttlig dödlighet, som förekommer i levern under sjukdomen. Metoden, från beredningen av lipidlösningsbestånden, blandningen, tillsatsen till mediet och hepatocytkulturen visas. Med detta tillvägagångssätt är det möjligt att identifiera lipiddroppar i hepatocyterna som lätt kan observeras av oljeröd O-färgning, liksom kurvor av spridning / dödlighet.

Introduction

Fettlever i samband med metabolisk dysfunktion är mycket utbredd över^{hela världen 1,2;} det uppskattas att upp till 25% av befolkningen påverkas³. Denna sjukdom som tidigare var känd som alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), har uppdaterat sin nomenklatur till metabolisk dysfunktion associerad fettleversjukdom (MAFLD) för att noggrant återspegla patogenesen i samband med fetma, insulinresistens, diabetes typ 2 och dyslipidemi, liksom de möjliga hanteringarna av sjukdomen^3,4.

Oavsett namn innehåller sjukdomen ett brett spektrum av histopatologiska förändringar som kännetecknas av onormalt hög ackumulering av lipider i levern (>5% fett i hepatocyterna⁵) och kan utvecklas genom lipidackumuleringen som vanligtvis finns i enkel steatohepatit, vilket i sin tur kan leda till utveckling av fibros, cirros, hepatocellulärt carcinom och leversvikt^5,6,7,8. På grund av dess ökande prevalens förväntas MAFLD bli den första indikationen på levertransplantation och den främsta orsaken till hepatocellulär carcinom⁹.

Även om det har betraktats som en godartad eller mild form av fettlever sjukdom, lever steatosis är i själva verket den metaboliska nyckeln i MAFLD¹⁰. Olika metaboliska vägar påverkas av lipid ackumulering i levern, inklusive men inte begränsat till lipidsyntes, export och metabolism¹⁰. Insulinresistens, oxidativ stress, retikulär stress och cellulär dysfunktion är starkt förknippade med lever lipotoxicity^11,12. Å andra sidan är feta hepatocyter målet för reaktiva syrearter, vilket gör metaboliter som lipidperoxider, proteinkarbonyler och addukter av nukleinsyror¹³. På cellnivå kan feta hepatocyter genomgå mitokondriell skada¹⁴, cellulär senescens¹⁵, apoptos¹⁶, pyroptos¹², och autofagi¹⁷, bland andra händelser.

Hepatocyter är mycket ansvariga för metabolism, avgiftning och syntes av ett brett spektrum av molekyler. Många av dessa funktioner kan äventyras av lipid ackumulering observeras i steatosis. Därför är det av stor betydelse att ha reproducerbara verktyg som möjliggör en korrekt utvärdering av steatos. I den meningen är in vitro-modeller lätt tillämpliga och mycket reproducerbara. Steatos in vitro har använts med olika mål^16,18,19. HepG2-cellerna används ofta som hepatocytcelllinje. Det har fördelar som att vara lätt att odla och väl karakteriserad. Kanske är den enda nackdelen med HepG2-celler det faktum att det är en cancerframkallande cellinje, så detta måste beaktas när man analyserar resultaten. Här visas applicering av en blandning av fettsyror som ofta används i cellkulturen: palmitinsyra (PA) och oljesyra (OA). Både PA och OA erbjuder olika resultat i kultur²⁰. PA (C 16:0) är den vanligaste mättade fettsyran som erhålls från kosten¹⁶. PA anses vara en biomarkör av de-novo lipogenes ,ett avgörande steg i utvecklingen av NAFLD²¹. PA har visat sig vara mycket^{giftigt 22.} Därför kanske det inte rekommenderas att inducera steatos in vitro. OA (C 18:1) är en enkelomättad fettsyra. I motsats till PA har OA föreslagits att ha antiinflammatoriska och antioxidantegenskaper, kunna motverka PA¹². Både PA och OA är de viktigaste fettsyrorna som finns i triglycerider, oavsett hälsotillstånd eller sjukdom¹⁶. Tabell 1 ger exempel på hepatocytkulturen med PA, OA och deras blandning, liksom de rapporterade^{resultaten 12,23,24,25,26,27}. Andra fettsyror har också använts i hepatocytkultur, inklusive stearinsyra (C 18:0)^28,29,30, linolsyra (C 18:1)^28,30,31 och dess konjugat (CLA)^28,32, palmitoleinsyra (C 16:1)²⁹. Deras användning rapporteras dock minst ofta i litteraturen, kanske för att deras leveröverskott är lägre än PA och OA¹⁶.

Tillsammans liknar båda fettsyrorna steatos in vitro, vilket ger prolifererande celler, med ökad celldöd och lägre livskraft jämfört med kontrollförhållanden. Det är värt att nämna att respektive salter av dessa fettsyror finns tillgängliga och kan användas också. Ett av de största problemen vid bedömning av lipidöverbelastning i hepatocytcellkulturen ges i differentiering mellan toxikologiska modeller och en modell som bäst representerar steatos. Många modeller kan redovisas i det första fallet. Faktum är att användningen av PA ensam kan övervägas bland dem, och den höga dödligheten är det mest uppenbara^{resultatet 12,16,23,24,25,26,27}. Användningen av höga doser även när det gäller OA kan också betraktas som en toxikologisk modell. Protokollet som visas här är i högre överensstämmelse med steatosutveckling eftersom det visar låg dödlighet jämfört med det som observerats i andra modeller och gör det möjligt att följa det under flera dagar med progressiv lipidackumulering som det förekommer i NAFLD. Möjligheten att bedöma mild och svår steatos genom experimentella tillstånd anses vara en annan fördel.

Fettsyror	Villkor		Resultat		Hänvisning
PA	Koncentration: 200 μM		Lipidackumulering		Yan et al, 201925.
	Tidsexponering: 24 timmar		Skador på hepatocyter
			Transaminas höjd
PA	Koncentration: 50, 100 och 200 μM		Lipidackumulering		Xing et al, 201924.
	Tidsexponering: 24 timmar
PA	Koncentration: 250 μM, 500 μM, 750 μM och 1 000 μM		Lipidackumulering		Wang et al, 202026.
	Tidsexponering: 24 timmar		Progressiv minskning av cellens livskraft
Blandning av OA/PA	Koncentration: 1 mM		Lipidackumulering		Xiao et al, 202027.
	Tidsexponering: 24 timmar		Rapporterar inte lipotoxicity
	Pris: 2OA:1PA
Blandning av OA/PA	Första stimuleringen med 200 μM och 400 μM PA och sedan andra stimuleringen med 200 μM OA		Lipid ackumulering.		Zeng et al, 202012.
	Koncentration:400 μM PA: 200 μM OA		Bevis på lipotoxicity framkallas av PA minskades genom stimulering av OA.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidsexponering: 24 timmar
Blandning av OA/PA	Koncentration: 400 μM PA: 200 μM OA		Lipidackumulering		Chen et al, 201823.
	Pris: 2PA:1OA
	Tidsexponering: 24 timmar
Blandning av OA/PA	Koncentration :50 och 500 μM		Generering av två typer av steatos: mild steatos och svår steatos.		Campos och Guzmán 2021
	Pris: 2PA:1OA		Simulerar kronisk utställning av lipidöverbelastning
	Tidsexponering: 24 timmar, 2 dagar, 3 dagar och 4 dagar.

Tabell 1. Hepatocyt kultur i steatogenic villkor. Tabellen presenterar vilken typ av fettsyra som används, de villkor som upprätthålls och de observerade resultaten i hepatocytkulturen. Palmitsyra. OA: Oljesyra.

Slutligen är denna modell tillämplig inte bara på studier av steatos och fettlever, men också på levermetaboliska, syntetiska och avgiftningsvägar i samband med steatos. In vitro-inducerad steatos kan också ge bevis för identifiering av potentiella markörer för sjukdomen samt terapeutiska mål.

Protocol

1. Standard och konditionerad medium förberedelse För att förbereda standard RPMI 1640, komplettera RPMI 1640 odlingsmedium med 10% (v/v) fetala nötkreatur serum (FBS, tidigare värme inaktiverad) och 1% (v/v) av Penicillin-Streptomycin lösning. Förvara mediet vid 4 °C.Sterilisera med hjälp av 0,22 μm filter. För att förbereda palmitatbuljonglösning, bered en 50 mM lösning av palmitat i standard RPMI 1640 tidigare kompletterad med 1% av bovint serumalbumin (lipidfritt). En volym på 5-10 …

Representative Results

Hepatocyter odlade i det steatogena mediet visar tillväxt över hela brunnens yta; Feta hepatocyter visar dock lägre tillväxthastighet jämfört med celler odlade i kontrollmedium. Det föreslagna förhållandet och koncentrationen av OA och PA, garanterar cellens överlevnad under kulturen. Sådd av 1 x 105 celler per brunn i 24-brunnsplattor ger optimal sammanflöde enligt figur 1. Livskraften i odlade celler var lägre i de steatogena grupperna Mi…

Discussion

Detta protokoll är avsett att ge en strategi för att studera steatos in vitro. Cellkultur är ett kraftfullt verktyg för att studera cellulära, molekylära, biokemiska och toxikologiska aspekter av de celler som utsätts för olika tillstånd. Med detta tillvägagångssätt kan steatos visualiseras inte bara som ett stadium av den komplexa sjukdomen som är MAFLD, men också som hepatocyt överexponering för lipider och de möjliga resultaten som härrör från sådan exponering. Därför är dess tillämpn…

Materials

Biosafety cabinet	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter	Corning, US	430513	Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	–
Hemocytometer	Marienfeld, DE	640010	–
HepG2 cell line	ATCC, US	HB-8065	Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator	Thermo Electronic Corporation,US	Model: 3110	Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse	NIKON, JPN	Model: TE2000-S	–
Isopropanol	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	–
Oil Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	–
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter	Beckman, US	Model: 360 PH/Temp/MV Meter	–
Phosphate buffered saline	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	–
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparation of culture media
Sodium oleate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	–
Sodium palmitate	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	–
Syring filter	Corning, US	431219	Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	–
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM	Corning, US	25-052-Cl	–
24 well cell culture cluster	Corning, US	3524	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster	Corning, US	3599	Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.