Dette papiret beskriver en magnetisk levitasjonsbasert metode som spesifikt kan oppdage tilstedeværelsen av antigener, enten løselige eller membranbundne, ved å kvantifisere endringer i levitasjonshøyden på fangstperler med faste tettheter.
Den beskrevne metoden ble utviklet basert på prinsippene for magnetisk levitasjon, som skiller celler og partikler basert på deres tetthet og magnetiske egenskaper. Tetthet er en celletype som identifiserer egenskap, direkte relatert til metabolsk hastighet, differensiering og aktiveringsstatus. Magnetisk levitasjon tillater en ett-trinns tilnærming for å skille, bilde og karakterisere sirkulerende blodlegemer, og å oppdage anemi, sigdcellesykdom og sirkulerende tumorceller basert på tetthet og magnetiske egenskaper. Denne tilnærmingen er også egnet til å oppdage løselige antigener tilstede i en løsning ved å bruke sett med lav- og høy tetthet perler belagt med henholdsvis fangst- og deteksjonsantistoffer. Hvis antigenet er til stede i løsningen, vil det bygge bro over de to settene med perler, og generere et nytt perle-perlekompleks, som vil levitere mellom radene med antistoffbelagte perler. Økt konsentrasjon av målantigenet i løsningen vil generere et større antall perle-perlekomplekser sammenlignet med lavere konsentrasjoner av antigen, og dermed muliggjøre kvantitative målinger av målantigenet. Magnetisk levitasjon er fordelaktig for andre metoder på grunn av redusert prøveforberedelsestid og mangel på avhengighet av klassiske avlesningsmetoder. Bildet som genereres, fanges og analyseres enkelt ved hjelp av et standard mikroskop eller mobilenhet, for eksempel en smarttelefon eller et nettbrett.
Magnetisk levitasjon er en teknikk utviklet for å skille, analysere og identifisere celletyper1,2,3, proteiner4,5 og opioider6 basert utelukkende på deres spesifikke tetthet og paramagnetiske egenskaper. Celletetthet er en unik, innebygd egenskap for hver celletype som er direkte relatert til dens metabolske hastighet og differensieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantifisering av subtile og forbigående endringer i celletetthet under stabile tilstandsforhold, og under en rekke celleprosesser, kunne man ha råd til en uovertruffen innsikt i cellefysiologi og patofysiologi. Endringer i celletetthet er knyttet til celledifferensiering15,16, cellesyklusprogresjon9,17,18,19, apoptose20,21,22,23og ondartet transformasjon24,25,26 . Derfor kan kvantifisering av spesifikke endringer i celletetthet brukes til å skille mellom celler av forskjellige typer, samt diskriminere mellom samme type celler som gjennomgår ulike aktiveringsprosesser. Dette muliggjør eksperimenter som retter seg mot en bestemt celleunderpopulasjon, der dynamiske endringer i tetthet fungerer som en indikator på endret cellemetabolisme27. Som det har blitt fastslått at en celle kan endre tettheten som svar på et miljø i endring7, er det viktig å måle cellens kinetikk i forhold til dens tetthet for å forstå den fullt ut, hvilke nåværende metoder som kanskje ikke gir12. Magnetisk levitasjon derimot, gir mulighet for en dynamisk evaluering av celler og deres egenskaper28.
Celler er diamagnetiske, noe som betyr at de ikke har et permanent magnetisk dipolmoment. Men når det blir utsatt for et eksternt magnetfelt, genereres et svakt magnetisk dipolmoment i cellene, i motsatt retning av det påførte feltet. Således, hvis celler er suspendert i en paramagnetisk løsning og utsatt for et sterkt vertikalt magnetfelt, vil de levitere bort fra magnetkilden og stoppe til en høyde, som hovedsakelig avhenger av deres individuelle tetthet. Diamagnetisk levitasjon av et objekt begrenset til minimum et inhomogent magnetfelt er mulig når de to følgende kriteriene er oppfylt: 1) Partikkelens magnetiske følsomhet må være mindre enn det omkringliggende mediet, og 2) den magnetiske kraften må være sterk nok til å motvirke partikkelens oppdriftskraft. Begge kriteriene kan oppfylles ved å suspendere RBCer i en magnetisk buffer og ved å skape sterke magnetfeltgradienter med små, billige, kommersielt tilgjengelige permanente magneter1. Likevektsposisjonen til en magnetisk fanget partikkel på en akse langs tyngdekraften bestemmes av dens tetthet (i forhold til bufferens tetthet), dens magnetiske følsomhet (i forhold til bufferens magnetiske følsomhet), og signaturen til det påførte magnetfeltet. Ettersom tettheten og de magnetiske egenskapene til løsningen er konstante i hele systemet, vil cellenes indre tetthetsegenskaper være den viktigste faktoren som bestemmer cellenes levitasjonshøyde, med tettere celler som levitterer lavere sammenlignet med mindre tette celler. Denne tilnærmingen bruker et sett med to tetthetsreferanseperler (1,05 og 1,2 g/ ml) som lar oss bruke presis, forholdsmetrisk analyse for tetthetsmålinger. Endring av konsentrasjonen av den magnetiske løsningen gjør det mulig å isolere forskjellige cellulære populasjoner, for eksempel RBCer fra WBCer, da tettheten av sirkulerende celler er cellespesifikk, og fjerner behovet for isolasjonsprotokoller eller annen cellemanipulering.
De fleste deteksjonsmetoder som brukes i biologiforskning er avhengige av ekstrapolering av spesifikke bindende hendelser til enkle å kvantifisere lineære signaler. Disse avlesningsmetodene er ofte komplekse og involverer spesialisert utstyr og dedikert vitenskapelig personell. En tilnærming rettet mot påvisning av antigener som finnes enten på plasmamembranen av celler eller ekstracellulære vesikler eller som er løselige i plasma, ved hjelp av enten en eller to antistoffbelagte perler, er heri beskrevet. Perlene må være av forskjellige tettheter fra hverandre og fra de av de forhørte målene. Tilstedeværelsen av målantigenet i en gitt biofluid er oversatt til en bestemt, målbar endring i levitasjonshøyden til en antigenpositiv celle som er bundet til en deteksjonsperle. Når det gjelder løselige antigener eller ekstracellulære vesicles, er de bundet til både fangst- og deteksjonsperler, og danner et perle-perlekompleks i stedet for perlecellekompleks. Endringen i levitasjonshøyde avhenger av den nye tettheten av perlecelle- eller perle-perlekompleksene. I tillegg til endringen i levitasjonshøyden til kompleksene, noe som indikerer tilstedeværelsen av antigen i biofluidet, er antall komplekser også avhengig av mengden mål, noe som gjør magnetisk levitasjon også en kvantitativ tilnærming for antigendeteksjon24.
Gradient sentrifugering er for tiden standardteknikken for å isolere subcellulære komponenter basert på deres unike tettheter. Denne tilnærmingen krever imidlertid bruk av spesialiserte gradientmedier samt sentrifugeringsutstyr. Den magnetiske levitasjonsmetoden som presenteres her, tillater detaljert undersøkelse av de morfologiske og funksjonelle egenskapene til sirkulerende celler, med minimum, om noen manipulering av cellene, noe som gir en nær in vivo-tilgang til sirkulerende celler.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Dr. Getulio Pereira for hans hjelp med ekstracellulært vesicle-arbeid.
Dette arbeidet ble støttet av følgende National Institute of Health-tilskudd til ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 og UG3TR002881.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |