Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie

Summary

Dit artikel beschrijft een op magnetische levitatie gebaseerde methode die specifiek de aanwezigheid van antigenen kan detecteren, oplosbaar of membraangebonden, door veranderingen in de levitatiehoogte van vanvangkralen met vaste dichtheden te kwantificeren.

Abstract

De beschreven methode is ontwikkeld op basis van de principes van magnetische levitatie, die cellen en deeltjes scheidt op basis van hun dichtheid en magnetische eigenschappen. Dichtheid is een celtype identificerende eigenschap, direct gerelateerd aan de stofwisseling, differentiatie en activeringsstatus. Magnetische levitatie maakt een aanpak in één stap mogelijk om circulerende bloedcellen met succes te scheiden, in beeld te brengen en te karakteriseren, en om bloedarmoede, sikkelcelziekte en circulerende tumorcellen te detecteren op basis van dichtheid en magnetische eigenschappen. Deze aanpak is ook vatbaar voor het detecteren van oplosbare antigenen die aanwezig zijn in een oplossing door gebruik te maken van sets kralen met lage en hoge dichtheid bedekt met respectievelijk vang- en detectieantistoffen. Als het antigeen in oplossing aanwezig is, zal het de twee sets kralen overbruggen en een nieuw kralencomplex genereren, dat tussen de rijen met antilichamen bedekte kralen zal zweven. Een verhoogde concentratie van het doelantigeen in oplossing zal een groter aantal kralencomplexen genereren in vergelijking met lagere concentraties antigeen, waardoor kwantitatieve metingen van het doelantigeen mogelijk zijn. Magnetische levitatie is voordelig voor andere methoden vanwege de verminderde monstervoorbereidingstijd en het gebrek aan afhankelijkheid van klassieke uitleesmethoden. Het gegenereerde beeld wordt eenvoudig vastgelegd en geanalyseerd met behulp van een standaardmicroscoop of mobiel apparaat, zoals een smartphone of een tablet.

Introduction

Magnetische levitatie is een techniek die is ontwikkeld om celtypen^1,2,3,eiwitten^4,5 en opioïden⁶ te scheiden, analyseren en identificeren, uitsluitend op basis van hun specifieke dichtheid en paramagnetische eigenschappen. Celdichtheid is een unieke, intrinsieke eigenschap van elk celtype die direct verband houdt met de stofwisseling en differentiatiestatus^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Het kwantificeren van subtiele en voorbijgaande veranderingen in celdichtheid tijdens steady state-omstandigheden en tijdens een verscheidenheid aan celprocessen, zou iemand een ongeëvenaard inzicht in celfysiologie en pathofysiologie kunnen bieden. Veranderingen in celdichtheid zijn geassocieerd met celdifferentiatie^15,16,celcyclusprogressie^9,17,18,19,apoptose^20,21,22,23en kwaadaardige transformatie^24,25,26 . Daarom kan kwantificering van specifieke veranderingen in celdichtheid worden gebruikt om onderscheid te maken tussen cellen van verschillende typen, en om onderscheid te maken tussen hetzelfde type cellen dat verschillende activeringsprocessen ondergaat. Dit maakt experimenten mogelijk die zich richten op een bepaalde celsubpopulatie, waarbij dynamische veranderingen in dichtheid dienen als een indicator van veranderd celmetabolisme²⁷. Aangezien is vastgesteld dat een cel zijn dichtheid kan veranderen als reactie op een veranderende omgeving⁷, is het noodzakelijk om de kinetiek van de cel te meten in relatie tot zijn dichtheid om deze volledig te begrijpen, wat de huidige methoden mogelijk niet bieden¹². Magnetische levitatie daarentegen zorgt voor een dynamische evaluatie van cellen en hun eigenschappen²⁸.

Cellen zijn diamagnetisch, wat betekent dat ze geen permanent magnetisch dipoolmoment hebben. Bij blootstelling aan een extern magnetisch veld wordt echter een zwak magnetisch dipoolmoment gegenereerd in de cellen, in de tegenovergestelde richting van het toegepaste veld. Dus als cellen worden opgehangen in een paramagnetische oplossing en worden blootgesteld aan een sterk verticaal magnetisch veld, zullen ze weg zweven van de magnetische bron en stoppen tot een hoogte, die voornamelijk afhangt van hun individuele dichtheid. Diamagnetische levitatie van een object dat beperkt is tot het minimum van een inhomogeen magnetisch veld is mogelijk wanneer aan de volgende twee criteria is voldaan: 1) de magnetische gevoeligheid van het deeltje moet kleiner zijn dan die van het omringende medium, en 2) de magnetische kracht moet sterk genoeg zijn om tegenwicht te bieden aan de drijfkracht van het deeltje. Aan beide criteria kan worden voldaan door RBC’s in een magnetische buffer op te hangen en door sterke magnetische veldgradiënten te creëren met kleine, goedkope, in de handel verkrijgbare permanente magneten¹. De evenwichtspositie van een magnetisch gevangen deeltje op een as langs de zwaartekrachtrichting wordt bepaald door zijn dichtheid (ten opzichte van de dichtheid van de buffer), zijn magnetische gevoeligheid (ten opzichte van de magnetische gevoeligheid van de buffer) en de signatuur van het toegepaste magnetische veld. Omdat de dichtheid en de magnetische eigenschappen van de oplossing constant zijn in het hele systeem, zullen de intrinsieke dichtheidseigenschappen van de cellen de belangrijkste factor zijn die de levitatiehoogte van de cellen bepaalt, waarbij dichtere cellen lager zweven in vergelijking met minder dichte cellen. Deze benadering maakt gebruik van een set van twee dichtheidsreferentieparels (1,05 en 1,2 g / ml) waarmee we nauwkeurige, ratiometrische analyse kunnen gebruiken voor dichtheidsmetingen. Door de concentratie van de magnetische oplossing te veranderen, kan men verschillende cellulaire populaties, zoals RBC’s, isoleren van WBC’s, omdat de dichtheid van circulerende cellen celspecifiek is, waardoor isolatieprotocollen of andere celmanipulatie niet meer nodig zijn.

De meeste detectiemethoden die in biologisch onderzoek worden gebruikt, zijn gebaseerd op extrapolatie van specifieke bindingsgebeurtenissen in gemakkelijk te kwantificeren lineaire signalen. Deze uitleesmethoden zijn vaak complex en omvatten gespecialiseerde apparatuur en toegewijd wetenschappelijk personeel. Een benadering gericht op de detectie van antigenen gevonden op het plasmamembraan van cellen of extracellulaire blaasjes of die oplosbaar zijn in plasma, met behulp van een of twee antilichaam gecoate kralen, wordt hierin beschreven. De kralen moeten van verschillende dichtheden zijn en van die van de ondervraagde doelwitten. De aanwezigheid van het doelantigeen in een bepaald biofluïde wordt vertaald in een specifieke, meetbare verandering in de levitatiehoogte van een antigeenpositieve cel die gebonden is aan een detectiekraal. In het geval van oplosbare antigenen of extracellulaire blaasjes zijn ze gebonden aan zowel vangst- als detectieparels, waardoor een kraal-kraalcomplex wordt gevormd in plaats van een kralencelcomplex. De verandering in levitatiehoogte hangt af van de nieuwe dichtheid van de kraalcel- of kraal-kraalcomplexen. Naast de verandering in de levitatiehoogte van de complexen, die de aanwezigheid van antigeen in de biofluïde aangeeft, is het aantal complexen ook afhankelijk van de hoeveelheid doel, waardoor magnetische levitatie ook een kwantitatieve benadering is voor antigeendetectie²⁴.

Protocol

Het experimentele protocol dat in deze studie werd gebruikt, werd goedgekeurd door de Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Instrument instellen OPMERKING: Voor het afbeelden van zwevende cellen moeten twee zeldzame aard neodymiummagneten die op de z-as zijn gemagnetiseerd, worden geplaatst met dezelfde pool naar elkaar toe om een magnetisch veld te genereren. De afstand tussen de magneten kan worden aangepast afhankelijk van de int…

Representative Results

Magnetische levitatie richt objecten van verschillende dichtheden op verschillende levitatiehoogten, afhankelijk van de dichtheid van het object, de magnetische signatuur, de concentratie van paramagnetische oplossing en de sterkte van het magnetisch veld gecreëerd door twee sterke, zeldzame aardmagneten. Omdat de twee magneten op elkaar zijn geplaatst, kunnen zwevende monsters alleen worden bekeken, met behoud van Köhler-verlichting, met behulp van een microscoop die op zijn kant isgedraaid (figuu…

Discussion

Gradiëntcentrifugatie is momenteel de standaardtechniek voor het isoleren van subcellulaire componenten op basis van hun unieke dichtheden. Deze aanpak vereist echter het gebruik van gespecialiseerde gradiëntmedia en centrifuge-apparatuur. De magnetische levitatiebenadering die hier wordt gepresenteerd, maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de morfologische en functionele eigenschappen van circulerende cellen, met minimale, indien enige manipulatie van de cellen, waardoor een bijna in vivo toegang tot ci…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube