Dette papir beskriver en magnetisk levitation-baseret metode, der specifikt kan opdage tilstedeværelsen af antigener, enten opløselige eller membran-bundet, ved at kvantificere ændringer i levitation højde fange perler med faste tætheder.
Den beskrevne metode blev udviklet baseret på principperne om magnetisk levitation, som adskiller celler og partikler baseret på deres tæthed og magnetiske egenskaber. Tæthed er en celletype identificere egenskab, direkte relateret til dens stofskifte, differentiering, og aktivering status. Magnetisk levitation giver mulighed for en et-trins tilgang til med succes at adskille, billede og karakterisere cirkulerende blodlegemer, og at opdage anæmi, seglcellesygdom, og cirkulerende tumorceller baseret på densitet og magnetiske egenskaber. Denne tilgang er også modtagelig for at opdage opløselige antigener til stede i en løsning ved hjælp af sæt af lav- og høj densitet perler belagt med fangst og detektion antistoffer, henholdsvis. Hvis antigen er til stede i opløsning, vil det bygge bro over de to sæt perler og generere et nyt perleperlekompleks, som vil svæve mellem rækkerne af antistofbelagte perler. Øget koncentration af målantigen i opløsningen vil generere et større antal perleperlekomplekser sammenlignet med lavere koncentrationer af antigen, hvilket giver mulighed for kvantitative målinger af målantigen. Magnetisk levitation er fordelagtig for andre metoder på grund af dens reducerede prøveforberedelsestid og manglende afhængighed af klassiske udlæsningsmetoder. Det genererede billede optages og analyseres nemt ved hjælp af et standardmikroskop eller en mobil enhed, f.eks. en smartphone eller en tablet.
Magnetisk levitation er en teknik udviklet til at adskille, analysere og identificere celletyper1,2,3, proteiner4,5 og opioider6 udelukkende baseret på deres specifikke tæthed og paramagnetiske egenskaber. Celletæthed er en unik, iboende egenskab for hver celletype, der er direkte relateret til dens stofskifte og differentieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantificering subtile og forbigående ændringer i celletæthed under steady state betingelser, og under en række celle processer, kunne give en en uovertruffen indsigt i cellefysiologi og patofysiologi. Ændringer i celletæthed er forbundet med celledifferentiering15,16, cellecyklus progression9,17,18,19, apoptose20,21,22,23og ondartet transformation24,25,26 . Derfor kan kvantificering af specifikke ændringer i celletætheden bruges til at skelne mellem celler af forskellige typer samt skelne mellem samme type celler, der gennemgår forskellige aktiveringsprocesser. Dette muliggør eksperimenter, der er målrettet mod en bestemt celleunderpopulation, hvor dynamiske ændringer i densitet tjener som en indikator for ændret cellemetabolisme27. Da det er blevet fastslået, at en celle kan ændre sin tæthed som reaktion på et skiftende miljø7, er det bydende nødvendigt at måle kinetikken i cellen i forhold til dens tæthed for at forstå den fuldt ud, hvilke nuværende metoder der muligvis ikke giver12. Magnetisk levitation på den anden side giver mulighed for en dynamisk evaluering af celler og deres egenskaber28.
Celler er diamagnetiske, hvilket betyder, at de ikke har et permanent magnetisk dipoløjemoment. Men når det udsættes for et eksternt magnetfelt, genereres et svagt magnetisk dipoløjemoment i cellerne i den modsatte retning af det anvendte felt. Således, hvis celler er suspenderet i en paramagnetisk opløsning og udsat for et stærkt lodret magnetfelt, vil de svæve væk fra den magnetiske kilde og stoppe til en højde, som primært afhænger af deres individuelle tæthed. Diamagnetisk levitation af et objekt, der er begrænset til et minimum af et inhomogent magnetfelt, er mulig, når følgende to kriterier er opfyldt: 1) partiklens magnetiske modtagelighed skal være mindre end det omgivende medium, og 2) den magnetiske kraft skal være stærk nok til at opveje partiklens opdriftskraft. Begge kriterier kan opfyldes ved at suspendere RBCs i en magnetisk buffer og ved at skabe stærke magnetfelt gradienter med små, billige, kommercielt tilgængelige permanente magneter1. Ligevægtspositionen af en magnetisk fanget partikel på en akse langs tyngderetningen bestemmes af dens tæthed (i forhold til bufferens massefylde), dens magnetiske modtagelighed (i forhold til bufferens magnetiske modtagelighed) og signaturen af det anvendte magnetfelt. Da opløsningens tæthed og magnetiske egenskaber er konstante i hele systemet, vil cellernes iboende tæthedsegenskaber være den vigtigste faktor, der bestemmer cellernes levitationshøjde, med tættere celler, der svæver lavere sammenlignet med mindre tætte celler. Denne tilgang bruger et sæt af to tæthed reference perler (1,05 og 1,2 g / mL), der giver os mulighed for at bruge præcis, ratiometrisk analyse for tæthed målinger. Ændring af koncentrationen af den magnetiske opløsning gør det muligt at isolere forskellige cellulære populationer, såsom RBCs fra WBCs, da tætheden af cirkulerende celler er cellespecifik, hvilket fjerner behovet for isolationsprotokoller eller anden cellemanipulation.
De fleste påvisningsmetoder, der anvendes i biologiforskning, er afhængige af ekstrapolering af specifikke bindende hændelser til let at kvantificere lineære signaler. Disse udlæsningsmetoder er ofte komplekse og involverer specialiseret udstyr og dedikeret videnskabeligt personale. En fremgangsmåde, der tager sigte på påvisning af antigener, der findes enten på cellernes plasmamembran eller ekstracellulære vesikler, eller som er opløselige i plasma, ved hjælp af enten en eller to antistofbelagte perler, er heri beskrevet. Perlerne skal være af forskellig tæthed fra hinanden og fra de forhørte mål. Tilstedeværelsen af målantigen i en given biofluid oversættes til en specifik, målbar ændring i levitationshøjden af en antigenpositiv celle, der er bundet til en detektionsperle. I tilfælde af opløselige antigener eller ekstracellulære vesikler er de bundet til både opsamlings- og detektionsperler, der danner et perleperlekompleks snarere end perlecellekompleks. Ændringen i levitationshøjden afhænger af den nye tæthed af perlecelle- eller perleadkomplekserne. Ud over ændringen i levitationshøjden af komplekserne, hvilket indikerer tilstedeværelsen af antigen i biofluiden, er antallet af komplekser også afhængig af mængden af mål, hvilket gør magnetisk levitation også en kvantitativ tilgang til antigendetektering24.
Gradient centrifugering er i øjeblikket standard teknikken til isolering subcellulære komponenter baseret på deres unikke tætheder. Denne tilgang kræver imidlertid brug af specialiserede gradientmedier samt centrifugeudstyr. Den magnetiske levitationsmetode, der præsenteres her, giver mulighed for detaljeret undersøgelse af cirkulerende cellers morfologiske og funktionelle egenskaber med minimum, hvis nogen manipulation af cellerne, hvilket giver en nær in vivo-adgang til cirkulerende celler.
<p clas…The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Getulio Pereira for hans hjælp med ekstracellulære vesikel arbejde.
Dette arbejde blev støttet af følgende Nationale Institut for Sundhed tilskud til ICG: RO1CA218500, UG3HL147353, og UG3TR002881.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |