כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי
Summary
מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ריחוף מגנטית שיכולה לזהות באופן ספציפי נוכחות של אנטיגנים, מסיסים או קשורים לממברנה, על ידי כימות שינויים בגובה הריחוף של חרוזי לכידה עם צפיפות קבועה.
Abstract
השיטה המתוארת פותחה על בסיס עקרונות הריחוף המגנטי, המפריד בין תאים וחלקיקים על סמך צפיפותם ומאפייניהם המגנטיים. Density הוא מאפיין מזהה סוג תא, הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו, לבידול ולמצב ההפעלה שלו. ריחוף מגנטי מאפשר גישה חד-שלבית כדי להפריד, לדם ולאפיין בהצלחה תאי דם במחזור, ולזהות אנמיה, מחלת חרמשית ותאי גידול במחזור המבוססים על צפיפות ומאפיינים מגנטיים. גישה זו מקובלת גם על זיהוי אנטיגנים מסיסים הנמצאים בפתרון באמצעות סטים של חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה מצופים בנוגדנים ללכידה וזיהוי, בהתאמה. אם האנטיגן נמצא בתמיסה, הוא יגשר בין שני סטים של חרוזים, יצירת קומפלקס חרוזים חדש, אשר מרחף בין השורות של חרוזים מצופים נוגדנים. ריכוז מוגבר של האנטיגן היעד בפתרון יפיק מספר גדול יותר של מתחמי חרוזים בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר של אנטיגן, ובכך יאפשר מדידות כמותיות של אנטיגן היעד. ריחוף מגנטי הוא יתרון לשיטות אחרות בשל זמן הכנת המדגם הירידה שלה וחוסר תלות בשיטות קריאה קלאסיות. התמונה שנוצרת נלכדת ומנותחת בקלות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי או מכשיר נייד, כגון טלפון חכם או טאבלט.
Introduction
ריחוף מגנטי הוא טכניקה שפותחה כדי להפריד, לנתח ולזהות סוגי תאים1,2,3, חלבונים4,5 ואופיואידים6 המבוססים אך ורק על הצפיפות הספציפית שלהם ואת המאפיינים paramagnetic. צפיפות תאים היא מאפיין ייחודי ומהותי של כל סוג תא הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו ומצב הבידולשלו 7,8,9,10,11,12,13,14. כימות שינויים עדינים וחולפים בצפיפות התאים בתנאי מצב קבועים, ובמגוון תהליכי תאים, יכול להרשות לעצמו תובנה שאין שני לה על פיזיולוגיה של תאים ופתופיזיולוגיה. שינויים בצפיפות התא קשורים לבידול תאים15,16, התקדמות מחזור התא9,17,18,19, אפופטוזיס20,21,22,23, ושינוי ממאיר24,25,26 . לכן, כימות של שינויים ספציפיים בצפיפות התא, יכול לשמש כדי להבדיל בין תאים מסוגים שונים, כמו גם להפלות בין אותו סוג של תאים העוברים תהליכי הפעלה שונים. זה מאפשר ניסויים המתמקדים תת-אוכלוסיית תאים מסוימת, שבו שינויים דינמיים בצפיפות משמש אינדיקטור של חילוף החומרים התא שונה27. כפי שנקבע כי תא עשוי לשנות את צפיפותו בתגובה לסביבה משתנה7, זה הכרחי למדוד את הקינטיקה של התא ביחס לצפיפותו כדי להבין אותו באופן מלא, אשר השיטות הנוכחיות לא יכול לספק12. ריחוף מגנטי לעומת זאת, מאפשר הערכה דינמית של תאים ומאפייניםשלהם 28.
תאים הם דיאמגנטיים כלומר אין להם רגע דיפול מגנטי קבוע. עם זאת, כאשר נחשפים לשדה מגנטי חיצוני, נוצר רגע דיפול מגנטי חלש בתאים, בכיוון ההפוך של השדה המיושם. לכן, אם תאים מושעים בתמיסה פרמגנטית ונחשפים לשדה מגנטי אנכי חזק, הם ירחפו הרחק מהמקור המגנטי ויעצרו לגובה, אשר תלוי בעיקר בצפיפות האישית שלהם. ריחוף דימגנטי של עצם המרותק למינימום של שדה מגנטי אינומוגני אפשרי כאשר שני הקריטריונים הבאים מתקיימים: 1) הרגישות המגנטית של החלקיק חייבת להיות קטנה מזו של המדיום שמסביב, ו -2) הכוח המגנטי חייב להיות חזק מספיק כדי לאזן את כוח הציפה של החלקיק. שני הקריטריונים יכולים להתממש על ידי השעיית RBCs במאגר מגנטי ועל ידי יצירת שיפועי שדה מגנטי חזקים עם מגנטים קבועים קטנים, זולים וזמינים מסחרית1. מיקום שיווי המשקל של חלקיק לכוד מגנטית על ציר לאורך כיוון הכבידה נקבע על ידי צפיפותו (ביחס לצפיפות המאגר), הרגישות המגנטית שלו (ביחס לרגישות המגנטית של המאגר) וחתימת השדה המגנטי המיושם. מכיוון שהצפיפות והמאפיינים המגנטיים של הפתרון קבועים בכל המערכת, תכונות הצפיפות המהותיות של התאים יהיו הגורם העיקרי הקובע את גובה הריחוף של התאים, כאשר תאים צפופים יותר מרחפים נמוך יותר בהשוואה לתאים צפופים פחות. גישה זו משתמשת בערכה של שני חרוזי התייחסות בצפיפות (1.05 ו- 1.2 גרם/מ”ל) המאפשרים לנו להשתמש בניתוח מדויק ויחסי למדידות צפיפות. שינוי הריכוז של הפתרון המגנטי מאפשר לבודד אוכלוסיות תאיות שונות, כגון RBCs מ- WBCs, שכן צפיפות התאים במחזור היא ספציפית לתא, הסרת הצורך בפרוטוקולי בידוד או מניפולציה אחרת של תאים.
רוב שיטות הזיהוי המשמשות במחקר ביולוגי מסתמכות על אקסטרפולציה של אירועים מחייבים ספציפיים לאותות ליניאריים קלים לכימות. שיטות קריאה אלה הן לעתים קרובות מורכבות וכוללות ציוד מיוחד ואנשי צוות מדעיים ייעודיים. גישה שמטרתה זיהוי של אנטיגנים שנמצאו על קרום הפלזמה של תאים או שלל חוץ תאי או כי הם מסיסים בפלזמה, באמצעות אחד או שניים חרוזים מצופים נוגדן, מתואר בזאת. החרוזים חייבים להיות בצפיפות שונה זה מזה וממטרות שנחקרו. נוכחותו של אנטיגן היעד בכל ביופלואיד נתון מתורגמת לשינוי ספציפי, מדיד בגובה הריחוף של תא אנטיגן חיובי כי הוא קשור חרוז זיהוי. במקרה של אנטיגנים מסיסים או שלל חוץ-תאי, הם קשורים הן לחרוזים ללכוד ולזיהוי, ויוצרות קומפלקס חרוזים ולא קומפלקס של תאי חרוזים. השינוי בגובה הריחוף תלוי בצפיפות החדשה של מתחמי חרוזים או חרוזים. בנוסף לשינוי בגובה הריחוף של המתחמים, המציין את נוכחות האנטיגן בביופלואיד, מספר המתחמים תלוי גם בכמות היעד, מה שהופך את הריחוף המגנטי גם לגישה כמותית לזיהוי אנטיגן24.
Protocol
Representative Results
Discussion
צנטריפוגה הדרגתית היא כיום הטכניקה הסטנדרטית לבידוד רכיבים תת-תאיים בהתבסס על הצפיפות הייחודית שלהם. גישה זו, לעומת זאת, דורשת שימוש במדיה הדרגתית מיוחדת, כמו גם ציוד צנטריפוגות. גישת הריחוף המגנטי המוצגת כאן מאפשרת חקירה מפורטת של התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של תאים במחזור, עם מינימ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר גטוליו פריירה על עזרתו בעבודה צעיפית חוץ-תאית.
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים של המכון הלאומי לבריאות ל- ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 ו- UG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
Referências
- Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
- Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
- Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).
- Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
- Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
- Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
- Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).
- Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
- Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
- Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
- Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
- Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
- Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
- Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
- Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
- Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
- Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
- Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
- Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
- Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
- Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
- Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
- Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).
- Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
- Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
- Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
- Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).
