Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica

Summary

Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell’altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.

Abstract

Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l’antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L’aumento della concentrazione dell’antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell’antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L’immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.

Introduction

La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule^1,2,3,le proteine^4,5 e gli oppioidi⁶ basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione^{7,8,9,10,11, 12,13,14.} Quantificare i cambiamenti sottili e transitori nella densità cellulare durante le condizioni di stato stazionario e durante una varietà di processi cellulari, potrebbe offrire una visione senza pari della fisiologia cellulare e della fisiopatologia. I cambiamenti nella densità cellulare sono associatialla differenziazione cellulare^15,16,alla progressione del ciclo cellulare^9,17,^18,19,all’apoptosi^20,21,22,23e alla trasformazione maligna^24,25,26 . Pertanto, la quantificazione di specifici cambiamenti nella densità cellulare, può essere utilizzata per differenziare tra cellule di diversi tipi, nonché discriminare tra lo stesso tipo di cellule sottoposte a vari processi di attivazione. Ciò consente esperimenti che prendono di mira una particolare sotto-popolazione cellulare, in cui i cambiamenti dinamici nella densità fungono da indicatore del metabolismo cellulare alterato²⁷. Poiché è stato stabilito che una cellula può alterare la sua densità in risposta a un ambiente mutevole⁷, è imperativo misurare la cinetica della cellula in relazione alla sua densità per comprenderla pienamente, che i metodi attuali potrebbero non fornire¹². La levitazione magnetica, d’altra parte, consente una valutazione dinamica delle cellule e delle loro proprietà²⁸.

Le cellule sono diamagnetiche, il che significa che non hanno un momento di dipolo magnetico permanente. Tuttavia, quando esposto a un campo magnetico esterno, viene generato un debole momento di dipolo magnetico nelle cellule, nella direzione opposta del campo applicato. Pertanto, se le cellule sono sospese in una soluzione paramagnetica ed esposte a un forte campo magnetico verticale, levitano lontano dalla sorgente magnetica e si fermano ad un’altezza, che dipende principalmente dalla loro densità individuale. La levitazione diamagnetica di un oggetto confinato al minimo di un campo magnetico disomogeneo è possibile quando sono soddisfatti i due seguenti criteri: 1) la suscettibilità magnetica della particella deve essere inferiore a quella del mezzo circostante e 2) la forza magnetica deve essere abbastanza forte da controbilanciare la forza di galleggiamento della particella. Entrambi i criteri possono essere soddisfatti sospendendo i globuli rossi in un buffer magnetico e creando forti gradienti di campo magnetico con magneti permanenti piccoli, economici e disponibili in commercio¹. La posizione di equilibrio di una particella intrappolata magneticamente su un asse lungo la direzione di gravità è determinata dalla sua densità (relativa alla densità del buffer), dalla sua suscettibilità magnetica (relativa alla suscettibilità magnetica del buffer) e dalla firma del campo magnetico applicato. Poiché la densità e le proprietà magnetiche della soluzione sono costanti in tutto il sistema, le proprietà di densità intrinseca delle cellule saranno il fattore principale che determina l’altezza di levitazione delle cellule, con cellule più dense che levitano più in basso rispetto alle cellule meno dense. Questo approccio utilizza una serie di due perle di riferimento di densità (1,05 e 1,2 g/ml) che ci consentono di utilizzare un’analisi puntuale precisa e rapportometrica per le misurazioni della densità. L’alterazione della concentrazione della soluzione magnetica consente di isolare diverse popolazioni cellulari, come i globuli rossi dai globuli bianchi, poiché la densità delle cellule circolanti è specifica della cellula, eliminando la necessità di protocolli di isolamento o altre manipolazioni cellulari.

La maggior parte dei metodi di rilevamento utilizzati nella ricerca in biologia si basano sull’estrapolazione di specifici eventi di legame in segnali lineari facili da quantificare. Questi metodi di lettura sono spesso complessi e coinvolgono attrezzature specializzate e personale scientifico dedicato. Un approccio volto alla rilevazione di antigeni trovati sulla membrana plasmatica delle cellule o delle vescicole extracellulari o che sono solubili nel plasma, utilizzando uno o due perle rivestite di anticorpi, è qui descritto. Le peri devono essere di densità diverse l’una dall’altra e da quelle dei bersagli interrogati. La presenza dell’antigene bersaglio in un dato biofluido si traduce in un cambiamento specifico e misurabile nell’altezza di levitazione di una cellula antigene-positiva che è legata a un perla di rilevamento. Nel caso di antigeni solubili o vescicole extracellulari, sono legati sia alle perle di cattura che a quelle di rilevamento, formando un complesso perle-perle piuttosto che un complesso perle-cellula. La variazione dell’altezza di levitazione dipende dalla nuova densità dei complessi perle-cella o perla-perla. Oltre alla variazione dell’altezza di levitazione dei complessi, che indica la presenza di antigene nel biofluido, il numero di complessi dipende anche dalla quantità di bersaglio, rendendo la levitazione magnetica anche un approccio quantitativo per il rilevamento dell’antigene²⁴.

Protocol

Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Configurazione dello strumento NOTA: l’imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull’asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all’altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all’intensità …

Representative Results

La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell’oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l’altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l’illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1</strong…

Discussion

La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l’uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L’approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un’indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.<…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); component of activation buffer
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness	K&J Magnetics	Custom	Magnets used for the magnetic levitation device
Capillary Tube Sealant (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Used to cap the ends of the capillary tubes
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Used to wash beads
Compact Lab Jack	Thorlabs	LJ750	Used for adjusting the magnetic levitation device
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	Solution for bead suspensions
Ethanolamine	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Used during a wash step for beads
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Used to stain Rh+ cells
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells
HBSS++	Gibco	14025-092	Solution for sample preparation
Human C5b,6 complex	Complement Technology, Inc	A122	Used to generate RBC Evs
Human C7 protein	Complement Technology, Inc	A124	Used to generate RBC Evs
Human C8 protein	Complement Technology, Inc	A125	Used to generate RBC Evs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	Used to generate RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Used to secure magnetic levitation device to lab jacks
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); used in antibody coupling reaction
Normal Rabbit IgG Control	R&D Systems	AB-105-C	Used to coat beads as a control condition
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	Component of coupling buffer, used for washing steps
Polysorbate 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Component of activation buffer
Polystyrene Carboxyl Polymer	Bangs Laboratories	PC06004	Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling
Rabbit RhD Polyclonal Antibody	Invitrogen	PA5-112694	Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells
Research Grade Microscope	Olympus	Provis AX-70	Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells
Rubber Dampening Feet	Thorlabs	RDF1	Used to support the breadboard table
Square Boro Tubing	VitroTubes	8100-050	Capillary tube used for loading sample into Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Used in antibody coupling reaction
Translational Stage	Thorlabs	PT1	Used for focusing and for scanning capillary tube