磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化
Summary
この論文では、固定密度の捕捉ビーズの浮上高さの変化を定量化することによって、可溶性または膜結合性の抗原の存在を特異的に検出できる磁気浮上ベースの方法について述べる。
Abstract
この方法は、密度と磁気特性に基づいて細胞と粒子を分離する磁気浮上の原理に基づいて開発されました。密度は細胞型識別性であり、その代謝率、分化、および活性化状態に直接関連する。磁気浮上により、循環血液細胞を分離し、画像化、特徴付け、密度や磁気特性に基づいて貧血、鎌状赤血球病、循環腫瘍細胞を検出するワンステップアプローチが可能になります。このアプローチは、それぞれ、捕獲および検出抗体でコーティングされた低密度および高密度ビーズのセットを使用して、溶液中に存在する可溶性抗原を検出するのに適しています。抗原が溶液中に存在する場合、それはビーズの2つのセットを橋渡しし、抗体コーティングされたビーズの列の間に浮上する新しいビーズ複合体を生成します。溶液中の標的抗原の濃度の増加は、より低い濃度の抗原と比較してより多くのビーズビーズ複合体を生成し、したがって標的抗原の定量的測定を可能にする。磁気浮上は、サンプル調製時間の短縮と古典的な読み出し方法への依存性の欠如のために他の方法に有利である。生成された画像は、スマートフォンやタブレットなどの標準的な顕微鏡やモバイルデバイスを使用して簡単にキャプチャおよび解析できます。
Introduction
磁気浮上は、細胞タイプ1、2、3、タンパク質4、5、オピオイド6を分離、分析、同定するために開発された技術であり、その特異的な密度と常磁特性のみに基づいて開発された技術です。細胞密度は、その代謝率および分化状態7、8、9、10、11、12、13、14に直接関連する各細胞型の固有の固有の性質である。定常状態の間、そして様々な細胞プロセスの間に、細胞密度の微妙で一過性の変化を定量化することは、細胞生理学および病理生理学に対する比類のない洞察を与えることができる。細胞密度の変化は、細胞分化15、16、細胞周期進行9、17、18、19、アポトーシス20、21、22、23、および悪性変換24、25、26に関連付けられる.したがって、細胞密度の特定の変化の定量化は、異なるタイプの細胞間で区別するとともに、異なる活性化プロセスを経て同じタイプの細胞を区別するために使用することができる。これにより、密度の動的変化が変化した細胞代謝の指標となる特定の細胞サブ集団を標的とする実験が可能になる。変化する環境7に応じて細胞の密度を変化させる可能性が確立されたので、その密度に関連して細胞の運動を完全に理解することが不可欠であり、現在の方法では12を提供しない可能性がある。一方、磁気浮上は、細胞およびその特性28の動的評価を可能にする。
細胞は、永久的な磁気双極子モーメントを持たないという対磁性の意味です。しかし、外部磁場にさらされると、適用された磁場の反対方向に、弱い磁気双極子モーメントが細胞内に生成されます。したがって、細胞が常磁性溶液に懸濁され、強い垂直磁場にさらされると、磁源から離れて浮上し、主に個々の密度に依存する高さに停止します。不均一磁場の最小値に限定された物体の直径磁気浮上は、次の2つの基準が満たされている場合に可能です:1)粒子の磁気感受性は周囲の媒体よりも小さくなければならない、そして2)磁力は粒子の浮力のバランスを取るのに十分な強さでなければならない。両方の基準は、磁気バッファー内のRBCsを懸濁させることによって、および小さく、安価で、市販の永久磁石1を用いて強い磁場勾配を作成することによって満たすことができる。重力の方向に沿った軸上の磁気的に閉じ込められた粒子の平衡位置は、その密度(バッファの密度に対する相対)、磁気感受性(バッファの磁気感受性に対する相対)、および適用された磁場の署名によって決定されます。溶液の密度と磁気特性はシステム全体で一定なので、細胞の固有密度特性は細胞の浮上高さを決定する主要な要因となり、密度の低い細胞と比較してより密度の高い細胞が低くなります。このアプローチでは、密度測定に正確な比比分析を使用できる 2 つの密度参照ビーズ(1.05 および 1.2 g/mL)のセットを使用します。磁気溶液の濃度を変更することで、循環細胞の密度が細胞特異的であるため、細胞特異的であるため、BVCからRbcsなどの異なる細胞集団を分離することができ、分離プロトコルやその他の細胞操作の必要性が取り除かれます。
生物学研究で使用される検出方法の大半は、線形信号を定量化しやすい特定の結合事象の外挿に依存しています。これらの読み出し方法は複雑な場合が多く、特殊な機器や専門の科学担当者が関与します。細胞または細胞外小胞の形質膜上に見出される抗原の検出を目的としたアプローチ、または血漿に可溶性である、1つまたは2つの抗体被覆ビーズのいずれかを使用して、本明細書に記載される。ビーズは、互いに異なる密度で、尋問対象のビーズとは異なる密度でなければなりません。任意の特定の生体流体中の標的抗原の存在は、検出ビードに結合している抗原陽性細胞の浮上高さの特異的で測定可能な変化に翻訳される。可溶性抗原または細胞外小胞の場合、それらは捕捉および検出ビーズの両方に結合し、ビーズ細胞複合体ではなくビーズ複合体を形成する。浮上高さの変化は、ビーズ細胞またはビーズの複合体の新しい密度に依存します。生体流体中の抗原の存在を示す複合体の浮上高さの変化に加えて、複合体の数も標的の量に依存し、磁気浮上も抗原検出24のための定量的アプローチを行う。
Protocol
Representative Results
Discussion
勾配遠心分離は、現在、そのユニークな密度に基づいて細胞下の成分を単離するための標準的な技術です。しかし、このアプローチでは、特殊な勾配媒体と遠心分離機装置を使用する必要があります。ここで提示される磁気浮上アプローチは、循環細胞の形態学的および機能的特性の詳細な調査を可能にし、細胞の操作を最小限に抑え、循環細胞への近く in vivo アクセスを提供する。<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、細胞外小胞の仕事に協力してくれたゲトゥリオ・ペレイラ博士に感謝したいと考えています。
この研究は、ICGに対する国立衛生研究所の助成金によって支援されました: RO1CA218500, UG3HL147353, およびUG3TR002881.
Materials
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
Referências
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